[发明专利]分泌酸性纤维素酶的转基因乳酸菌及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，本发明涉及分泌酸性纤维素酶的转基因工程乳酸菌及其制备方法和应用。

背景技术

1、问题的提出

随着人口数量的增加，人类需要更多的粮食，这种需求因越来越多的土地非农田化、沙化、退化及气候变化引起的频繁自然灾害而更加严重；人民生活水平的提高，对肉、蛋、奶、皮等畜产品的数量和质量需求在迅速增加，发展节粮型畜牧业是解决人畜争粮现象的有效途径之一，尤其在解决反刍动物对粗饲料利用率低下问题就成为一个现实课题。纤维素虽然是丰富的可再生有机资源，自然界也中广泛地存在着能降解纤维素的微生物，其中包括细菌、真菌和放线菌等(Tomme等，1995)，但人们对纤维素的有效利用更多地依赖于人们对纤维素酶的发现和认识。纤维素酶的研发与利用已经对包括食品、饲料、纺织在内许多行业的发展产生深远的影响，近年来，分子生物学与基因工程研究发展将会加快纤维素酶更广泛应用于工农业生产的进程，这对人类解决能源危机、粮食短缺、环境污染等难题都具有现实意义。

利用纤维素酶提高纤维素的利用率主要有以下两个方面的内容：外源纤维素酶的添加和内源纤维素酶的调控。过去几十年的研究大多集中在：分泌纤维素酶高产菌株的选育、纤维素酶的工业化生产、推广和应用，即外源纤维素酶的添加。随着时间的推移和科技进步的发展，消化酶的外源添加似乎已经达到了一个相对稳定的平台阶段，所以对消化酶的研究逐渐进入到研究内源纤维素酶的调控阶段。

反刍动物之所以能够有效地利用粗饲料主要是依靠瘤胃微生物的作用。瘤胃微生物对饲料的发酵是导致反刍动物和非反刍动物消化代谢特点的根本原因。粗饲料在瘤胃的微生物降解过程是通过一系列可分解纤维素和非分解纤维素微生物共同作用完成(Flint和Forsberg，1995)，实质上是由多种微生物参加、多种消化酶参与的复杂酶促反应，所以一切影响瘤胃微生物数量、种类和酶活力的因素都将影响反刍动物对粗饲料的利用。众所周知，酶催化的反应除了主要受底物浓度和酶活力影响外，还受温度和pH值的影响，由于牛、羊等反刍动物的体内温度又基本恒定，所以反刍动物瘤胃微生物利用纤维素的酶促反应的主要影响因素为pH值。反刍动物瘤胃纤维分解菌消化植物细胞壁的能力是一个细菌种类、牧草种类和消化发生所在的瘤胃环境的函数，作为影响纤维消化基本环境因素的pH值已成为研究焦点。

研究表明，瘤胃的pH受饲料类型和组成的影响。精饲料易发酵，单位重量产生的VFA比粗饲料的多，同时精饲料的密度大和颗粒小，使采食和反刍消耗的时间少，所以唾液产量相对较少，使瘤胃pH值降低(周建民等，1999)。郝正里等报道，喂低质草料时，瘤胃液pH值较高；粗饲料经粉碎或制粒，导致pH值降低；喂精饲料比例较高的饲料时，pH常较低，且食后下降速度快。

瘤胃pH动态变化受进食的影响最大。动物采食饲料后，碳水化合物在瘤胃中发酵产生挥发性脂肪酸，挥发性脂肪酸产生的速度快、数量多，而瘤胃上皮对挥发性脂肪酸的吸收及流出慢于产生的速度，所以瘤胃中挥发性脂肪酸的浓度逐渐升高，导致pH值下降，从理论上将发酵所产生的酸可以使瘤胃液的pH值降至2.5～3.0。而随着碳水化合物发酵产生的挥发性脂肪酸浓度的下降，瘤胃上皮对挥发性脂肪酸的吸收及流出的速度相对加快，瘤胃中挥发性脂肪酸的浓度下降，另外反刍动物的唾液含丰富的碳酸氢钠和磷酸盐，唾液不断流入瘤胃使挥发性脂肪酸得到中和导致pH值上升，所以通常情况下其pH值却维持在5.5～6.5。反刍动物的唾液分泌是由采食、咀嚼和反刍过程决定的。饲料结构越粗糙、饲料中粗饲料比例越高，动物采食、咀嚼和反刍的时间就越长，产生的唾液就越多，对瘤胃的缓冲就越强，pH值就升高(赵广永，1999)。

只有一个相当窄的pH范围适于瘤胃纤维的消化。Hoover等发现，纤维素和干物质消化的最适宜的pH值为6.5，无论5.5还是7.5都能显著地降低纤维的消化率。周韶和李树聪就报道高精料水平的饲料在饲喂后2.5～8.0h之间pH值低于6.2，此时会影响瘤胃微生物的正常活动和饲料纤维素和蛋白质的利用。当瘤胃pH值低于6.0时，纤维分解菌及产甲烷菌的生长及代谢活动降低；pH≤5.5时原虫消失(张庆才，1998)。Stewart(1977)发现添加大麦瘤胃pH值和纤维素分解随之下降主要是纤维素分解菌的数量减少的缘故，在pH值6.9时，每毫升瘤胃内容物有106个滤纸降解菌，当pH值为6.0时下降到103个。