[发明专利]肿瘤转移抑制基因HTPAP的单体型及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属基因工程领域，具体涉及一抑癌基因HTPAP的单体型及其构建方法和应用。 

背景技术

现有技术公开了染色体8p缺失与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，以下简称HCC)复发转移相关，并在此基础上克隆出一全长基因HTPAP。该基因是一候选肝癌转移抑制基因，其正式名为PPAPDC1B(Phosphatidic acid phosphatase type 2domaincontaining 1B)，即含有1B功能域的2型磷脂酸磷酸酯酶。该基因定位于8p12，含有7个外显子，6个内含子。基因全长4459bp，cDNA长为826bp，编码一个具有175个氨基酸的蛋白质。该基因同源序列在动物(如黑猩猩、狗、小家鼠等)和植物(如水稻)、从低等生物到高等生物中广泛存在，说明该基因可能有重要作用以至于在长期进化过程中未被淘汰。已有研究发现一些人类肿瘤中该基因的异常转录表达，提示该基因具有抑制肿瘤细胞增殖，降低侵袭性，抑制肿瘤转移的发生发展的作用。现有技术还公开了经体内、体外研究初步证实该基因可抑制HCC的侵袭和转移，提示HTPAP基因是一新的HCC转移抑制基因.该基因是新近发现的肿瘤相关基因，其功能研究报道目前尚不多。 

单核苷酸多态性(SNP)是在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的一种DNA序列多态性，是人类基因组中最常见的遗传变异，为第三代分子遗传标记。因为单个SNP本身的功能有限、利用单个位点SNP分析评价HTPAP基因作用是不够全面的，它提供的信息量也较少。已有研究发现，由于SNP之间存在连锁不平衡，位于同一条染色体上相邻的SNP等位基因往往倾向于同时出现，并以一个整体遗传给后代。而这些位于一条染色体特定区域的一组相互关联并倾向于以整体遗传给后代的SNP的组合即为单体型。它决定了基因的功能单位和人群遗传变异的内在特征。单体型的存在可以极大地减少疾病关联研究的工作量，在肿瘤侯选基因研究具有重要的作用。 

发明内容

本发明的目的是提供肿瘤转移抑制基因HTPAP的单体型。 

本发明的进一步目的是提供上述单体型的用途。 

本发明的更进一步目的是提供含上述单体型的诊断、预后预测HCC复发的试制盒。 

本发明可用于探讨不同的单体型与HCC的复发转移的关系，能为肝癌转移复发、预后预测提供新的途径和分子指标。 

本发明的目的通过下述技术方案实现， 

采用焦磷酸测序方法(Pyrosequencing 96，PSQ 96)对dbSNP多态性数据库中(美国国立生物技术信息中心Natinoal Center of Biotechnology Information，NCBI)HTPAP基因的15个SNP位点(rs1149、rs3739252、rs7845496、rs4599776、rs10087284、rs7007097、rs10099288、rs10102847、rs15103、rs8349、rs3215009、rs3830326、rs28431298、rs11539529、rs13256516)进行检测；分析每个位点序列特点，设计并合成特定的PCR引物及测序引物，PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记。然后将PCR产物与偶联Avidin的Sepharose微珠一起孵育经碱变性分开DNA双链后纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物特异性退火结合，PSQ仪器即可测序反应并给出SNP测定结果。上述结果均经采用ABI-3730测序仪直接测序相结合的方法进行验证。 

根据上述15个SNP的检测结果，选择有信息并最少等位基因频数(minor allelefrequency，MAF)大于或等于10％的SNP进行单体型构建分析。采用Haploview version3.32和PHASE 2.1分析软件(http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/PHASE2.1)，分析单体型结构及其频数和连锁不平衡。 

本发明通过对864例HCC病人的肿瘤抑制基因HTPAP的目前所有的SNP位点检测，对该基因进行单体型构建。