[发明专利]一种黄檗丛枝菌根真菌菌群结构的分析方法

权利要求书

1、一种黄檗丛枝菌根真菌菌群结构的分析方法，其特征在于黄檗丛枝菌根真菌菌群结构按以下步骤进行分析：一、黄檗丛枝菌根和黄檗根际土壤丛枝菌根真菌总DNA提取；二、Nested-PCR扩增真菌18SrDNA NS31/Glo1区：进行三次PCR扩增；三、用步骤二第三次PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳：采用变性聚丙烯酰胺凝胶，凝胶变性梯度范围30％～60％、电泳电压130V、电泳时间8h、电泳温度为60℃；四、采用DNA测序技术，即可分析出黄檗丛枝菌根真菌的菌群结构；

其中步骤二中第一次PCR扩增的引物为GeoA2：5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和Geo11；5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′；第一次PCR扩增体系为20μL由2μL含Mg²⁺10×PCR buffer、1.6μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、2μL浓度为1.0μmol/L的Geo11、2μL浓度为1.0μmol/L GeoA2、1U的Taq DNA聚合酶、2μL菌群总DNA和余量的无菌双蒸馏水组成；第一次PCR扩增反应条件：94℃预变性4min，94℃变性1min、54℃退火1min、72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸7min；

步骤二中第二次PCR扩增以稀释100倍的第一次PCR扩增产物作为模板DNA  ，第二次PCR  扩增引物为NS31-GC：5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3′和AM1：5′-GTTTCCCGTAAGGCGCCGAA-3′；第二次PCR扩增体系为20μL由2μL含Mg²⁺10×PCR buffer、1.6μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、2μL浓度为1.0μmol/L的Geo11、2μL浓度为1.0μmol/L GeoA2、1U的Taq DNA聚合酶、2μL模板DNA和余量的无菌双蒸馏水组成；第二次PCR扩增反应条件：94℃预变性2min，94℃变性45s、65℃退火1min、72℃延伸45s，30个循环，最后72℃延伸7min；

步骤二中第三次PCR扩增以稀释100倍的第二次PCR扩增产物作为模板DNA，第三次PCR扩增引物为NS31-GC：5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3′和Glol：5′-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3′；第三次PCR扩增体系为20μL由2μL含Mg²⁺10×PCR buffer、1.6μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、2μL浓度为1.0μmol/L的Geo11、2μL浓度为1.0μmol/L GeoA2、1U的Taq DNA聚合酶、2μL模板DNA和余量的无菌双蒸馏水组成；第三次PCR扩增反应条件：94℃预变性2min，94℃变性45s、55℃退火1min、72℃延伸45s，30个循环，最后72℃延伸7min；

步骤三中的聚丙烯酰胺凝胶按质量百分比基本上由8％的丙烯酰胺制成。

2、根据权利要求1所述的一种黄檗丛枝菌根真菌菌群结构的分析方法，其特征在于步骤一中按以下步骤提取黄檗丛枝菌根总DNA：a、长度为1～1.5cm的黄檗丛枝菌根用双蒸馏水清洗3～5次后放入离心管中，再加入40μL的TE缓冲液，并用无菌枪头将菌根捣碎，然后加入10μL质量浓度为20％的化学整合树脂Chelex-100溶液，之后沸水浴5min、冰浴5min、15000r/min离心5min，取上清液，即得到黄檗丛枝菌根总DNA。

3、根据权利要求1所述的一种黄檗丛枝菌根真菌菌群结构的分析方法，其特征在于步骤一中按修改后的Bead-Beating法提取黄檗根际土壤丛枝菌根真菌总DNA。