[发明专利]一种用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于扩增美丽盾巨孢囊霉的特异性引物。

背景技术

美丽盾巨孢囊霉(Scutellospora calospora)是一种丛枝菌根(arbuscularmycohizal，AM)真菌，因为菌根包括内生、外生、内外生菌根等，外生真菌是可培养的，而AM真菌为内生菌根真菌的一种，它才是不可培养的。如果缺乏必需的植物根系共生则无法完成生活史，不能继续繁殖、存活，即不能纯培养。AM真菌不能纯培养，虽然可以利用湿筛倾析法从植物根际土壤中获得AM真菌单个孢子，然后对单个AM真菌孢子进行DNA提取，使用真核生物通用引物即可将其扩增出来、测序等技术就可以知道其序列，但是如果在多种菌共同存在的混合DNA样品中，尚无法用现有的引物对从混合DNA样品中直接扩增出具有美丽盾巨孢囊霉(Scutellospora calospora)遗传特性的25SrDNA D1/D2可变区域部分序列，给AM真菌侵染根系的检测带来了困难。

发明内容

本发明是为了解决现有的引物无法从混合DNA样品中直接扩增出具有美丽盾巨孢囊霉(Scutellospora calospora)遗传特性的25S rDNA D1/D2可变区域部分序列的问题，而提供一种用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物。

本发明用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物为5′-TTAAAGCCATTACGTCAGCG-3′。

将本发明用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物命名为S.cal。

本发明的引物是根据不同的AM真菌DNA的D1区序列大小基本相同，而D2区有一个大约50bp的插入序列，不同的AM真菌该插入序列碱基差异大的特点而设计的。将本发明的引物S.cal(作为反向引物)与通用引物对中的LR1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGA-3′)配对使用，即可从混合DNA样品中直接扩增出长度为718bp的美丽盾巨孢囊霉(Scutellospora calospora)目的片段。

附图说明

图1为用具体实施方式二的引物对不同的DNA样品扩增出的序列的凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物为5′-TTAAAGCCATTACGTCAGCG-3′。

具体实施方式二：本实施方式用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物5′-TTAAAGCCATTACGTCAGCG-3′作为反向引物。

将正向引物LR1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGA-3′)与本实施方式的反向引物配对使用。分别以含有Scutellospora calospora DNA的混合样品、Scutellospora calospora DNA样品和不含Scutellospora calospora DNA的混合样品为模板进行引物S.cal的特异性验证试验。PCR扩增体系及反应条件如下：

扩增反应体系为20μL由2.0μL DNA模板，1.6μL浓度为2.5mmol/L的dNTP，2.0μL 10×缓冲液(不含Mg²⁺)，2.0μL浓度为25mmol/L的MgCl₂，2.0μL浓度为10pmol/L的引物，0.2μL浓度为5U/μL的Taq酶(DNA聚合酶)和余量的重蒸馏水组成；扩增反应条件：预变性95℃3min，变性93℃1min，退火58℃ 1min，延伸72℃ 1min，共30个循环，延伸72℃ 5min。

将本实施方式扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示，图1中M泳道为标准条带，1号和2号泳道中的条带为含有Scutellosporacalospora DNA的混合样品扩增结果，3号和4号泳道中的条带为Scutellosporacalospora DNA样品扩增结果，5号和6号泳道中的条带为不含Scutellosporacalospora DNA的混合样品扩增结果。从图1中可以看出本实施方式用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物能够准确扩增出美丽盾巨孢囊霉(Scutellospora calospora)的25S rDNA D1/D2可变区域部分序列片段。将1、2、3、4号泳道对应的序列片段分别与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞测序，测序结果为：序列长度为718bp，并且经blast分析，为美丽盾巨孢囊霉(Scu.calospora)特异性序列。

序列表