[发明专利]角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因及其制备方法和所用引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种几丁质酶基因密码子偏爱性突变体基因及其制备方法和所用引物。

背景技术

角毛壳菌几丁质酶基因(命名为chi58)的基因序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的氨基酸序列(角毛壳菌几丁质酶)如SEQ ID NO：3所示。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是20世纪90年代发展起来的优秀的真核表达系统，但是在巴斯德毕赤酵母中获得高效表达的外源基因往往都是酵母偏爱密码子所编码的基因；所以角毛壳菌几丁质酶基因(chi58)在巴斯德毕赤酵母中不能高效表达。

发明内容

本发明的目的是为了解决角毛壳菌几丁质酶基因(chi58)在巴斯德毕赤酵母中不能高效表达的问题，而提供的一种chi58密码子偏爱性突变体基因及其编码的氨基酸和基因的制备方法及所用引物。

本发明角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性改造突变体基因序列如SEQID NO：2所示。

本发明角毛壳菌几丁质酶基因密码子偏爱性改造突变体基因按以下步骤制备：

一、提取角毛壳菌总RNA：

二、分离角毛壳菌几丁质酶基因：采用RT-PCR法分离角毛壳菌几丁质酶基因，再以角毛壳菌几丁质酶cDNA第一链为模板进行PCR扩增；

三、克隆步骤二PCR扩增产物：回收PCR扩增产物，然后与pMD-18T克隆载体连接，再转化E.ColiJM109感受态细胞，并进行蓝白斑筛选；

四、挑取阳性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47进行PCR，PCR反应条件为95℃预变性10min，94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸90s、共35个循环，72℃延伸10min；

五、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段A：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L引物Pn1、1μL浓度为20μmol/L引物Pn2、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH₂O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、56.8℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物Pn1的基因序列为5’-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3’；下游引物Pn2的基因序列为5’-TTGAGTCTCGCTCTTAGTCTCTTGAGCAGGTTGACG-3’；

六、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段B：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L引物Pn3、1μL浓度为20μmol/L引物Pn4、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH₂O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、57.2℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物Pn3的基因序列为5’-GCTCAAGAGACTAAGAGCGAGACTCAACAGCATC-3’；下游引物Pn4的基因序列为5’-ACTCTCTCGGGGTTGATGTTGTTTCTCCAAAGCAGC-3’；

七、以步骤四PCR扩增产物pMD18-T-chi58为模板突变扩增待融合片段C：PCR反应体系为50μL，由5μL 10×pyrobest buffer、4μL dNTP、1μL浓度为20μmol/L引物Pn5、1μL浓度为20μmol/L引物Pn6、0.25μL高信度扩增酶Pyrobest DNA polymerase、1μL突变扩增模板和余量的ddH₂O组成；PCR反应条件为94℃变性30s、58.5℃退火30s、72℃延伸1min，共25个循环；其中上游引物Pn5的基因序列为5’-GGAGAAACAACATCAACCCCGAGAGAGTCAACC-3’；下游引物Pn6的基因序列为5’-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3’；