[发明专利]HCMV－Towne－GFP重组巨细胞病毒及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒，其特征在于：包括人类巨细胞病毒基因组和US9-US10位点之间插入有绿色荧光蛋白基因的PHM673质粒。

2.根据权利要求1所述的HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒的制备方法，其特征在于：步骤如下：

(1)细胞和病毒的培养：用含10％小牛血清的1640培养液，在37℃，5％CO₂孵箱中传代培养人胚肺细胞；将人巨细胞病毒Towne标准毒株接种于上述人胚肺细胞，常规传代，用Reed-Muench法测定病毒滴度，-80℃冰箱保存；

(2)质粒的转化：用PHM673质粒转化感受态大肠杆菌细胞，得到转化；然后进行质粒的中量抽提，在紫外分光光度计上测量获得的产物的DNA含量，并进行电泳鉴定质粒，然后进行质粒的纯化，获得纯化的PHM673质粒；

(3)病毒重组：①脂质体转染及转化克隆重组病毒的获得：脂质体转染24小时后去掉培养液，将0.2ml HCMV-Towne标准毒株加入细胞培养孔，32～35℃吸附1小时，增加培养基的体积至2ml，在5％CO₂、37℃孵箱中孵育24小时；换用含200ug/ml G418的选择培养基继续培养，以后每隔3天换一次选择培养基，用反复冻融法收集病毒液，-80℃或液氮保存；②重组病毒空斑的纯化：接种人胚肺细胞在12孔板中，用上述病毒液感染人胚肺细胞，37℃、5％CO₂孵育8～12天，荧光倒置显微镜观察，将荧光阳性孔挑出，即为转染成功的重组病毒，转移至新的人胚肺细胞中增殖。

3.根据权利要求1所述的HCMV-Towne-GFP重组巨细胞病毒在抗巨细胞病毒药物筛选中的应用。