[发明专利]一种水产动物SNP标记筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于水产生物技术领域中的水产动物分子标记筛选技术，具体涉及一种水产动物SNP标记筛选的新方法，适合于在水产动物中发现和筛选SNP分子标记。

背景技术

SNP(单核苷酸多态性)作为第三代分子标记，具有以下特点：SNP为双等位型标记；SNP在DNA分子上分布不均匀；S NP有很高的密度；SNP具有遗传稳定性；SNP的检测和分析易实现自动化。SNP在高密度遗传连锁图谱构建、性状相关分子标记筛选等方面发挥着越来越重要的作用。大量基因组序列信息的获得对于SNP的发现至关重要，所以目前SNP研究主要集中在人类及各种模式生物上，其在非模式生物上的研究受到了极大限制。在水产领域内，SNP研究更为罕见，并且所用的方法存在诸多不足，严重制约了SNP标记在水产领域内的应用。

目前，水产动物上SNP的开发方式主要有两种：一种是基于大量序列信息的筛选方式(He et al.，2003；Smith et al.，2005；Bradleyet al.，2007)，这种方式主要集中在模式鱼类-斑马鱼及重要经济鱼类-鲑鱼等种类上。因为这种基于大规模测序的方法，成本较高，并不适合于所有经济鱼类的SNP开发，所以并没有得到普及。第二种是针对候选基因的SNP开发(Tao and Boulding，2003；andPrimmer，2006)，这类方法在经济鱼类上有一定的应用前景，成本较低，但由于需要首先进行基因克隆，其效率较低，而且由于SNP的连锁性，邻近的SNP位点往往以单倍型的形式存在，难以得到大量有效的SNP位点。

因而，在水产动物上，亟需一种能够有效开发大量SNP位点，并且成本较低的方法。我们发明的这种方法，可以在整个基因组内批量寻找SNP位点，具有高效率、低成本的特点，有利于SNP标记在水产动物上的推广应用。

为此，本发明提出了一种全新的SNP标记筛选方法。

发明内容

本发明提供了一种水产动物SNP标记筛选方法，可以解决现有技术存在的效率低、成本高的问题。

本发明的目的是建立一种全新的SNP标记开发方法，能够在基因组序列信息较少的情况下，获得大量的SNP标记，为基因组序列未知的非模式生物及水产经济动物提供筛选大量SNP标记的新方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种水产动物SNP标记筛选方法，其特征在于包括如下步骤：

1)基因组DNA提取

按照常规酚氯仿方法分别提取8-12个半滑舌鳎个体的高纯度DNA，取少量样本放入研钵中，加少许液氮研磨，直至组织被碾成粉末，将粉末转入离心管中并加入DNA提取液TENS，然后再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液，混匀直至形成乳状液，室温下离心，取上清，重复抽提两次，向上清液中加入1/10体积的NaAc和2倍体积的冰冷无水乙醇，使DNA沉淀10-30分钟，70％乙醇漂洗沉淀，TE溶解DNA，测定DNA浓度后，将8-12个个体的DNA等量混合形成DNA池；

2)MseI限制性内切酶酶切，接头连接及预扩增

取1-2μg混合后的基因组总DNA，加入50-100单位内切酶MseI进行酶切反应，65℃温浴1.5-2.5小时，酶切产物经纯化后，用TE溶解，取部分纯化的酶切产物与序列为5-TACTCAGGACTCAT-3/5-GACGATGAGTCCTGAG-3的MseI接头用T4连接酶16℃连接过夜，然后对连接产物进行PCR预扩增，用以富集DNA产物，PCR预扩增反应混合物中含有稀释10倍后的5μL酶切-连接产物、终浓度为0.4μM、序列为5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’的MseI-N引物、1×PCR缓冲液、0.2μM的dNTP以及1U的Taq DNA聚合酶，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火1min，72℃延伸1min进行20个循环，最后72℃延伸10min，反应产物用1％琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量，PCR产物应该为一分步均匀的弥散带；

3)杂合双链的形成，CEL I酶切及Bst DNA聚合酶延伸