[发明专利]黑籽南瓜离体培养获得再生植株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种黑籽南瓜离体培养获得再生植株的方法，属于植物组织培养领域。

背景技术

黑籽南瓜是一种一年生蔓生植物，主要分布在高海拔地区，与同属的其他种相比差异较大，且与他们不能杂交产生后代。起源中心目前尚未统一，大部分人认为是美洲。目前主要分布于墨西哥、智利、德国、法国、日本、菲律宾和中国(Andrés 1990；Meng and Zeng 2000)。黑籽南瓜用途广泛，未成熟的果实可以煮熟吃或者作为蔬菜罐头，成熟的新鲜果实可以制作酒精饮料；黑籽南瓜最重要的营养价值是它的种子中含有大量的蛋白质和精油(Andrés，1990)；黑籽南瓜还具有降血压和减缓糖尿病的功效(Alarcon-Aguilar et al.2002；Roman-Ramos et al.1995；Roman-Ramos et al.1992)；最近智利的研究表明，黑籽南瓜新鲜果实的提取酶类可以有效地处理来自于鱼类加工企业排出的废水。

黑籽南瓜根系强大、耐贫瘠、耐寒、耐旱、抗枯萎黄萎病，常作为许多瓜类嫁接的砧木[European and Mediterranean Plant Protection Organization(OEPP/EPPO)2004]。但是，黑籽南瓜还有许多不良的性状，例如对根腐病敏感和不抗根结线虫病等，因此需要对其进行遗传改良研究。

目前关于黑籽南瓜再生体系的研究与其他瓜类作物(Colijn-Hooymansa，1988；Trulsonand Shahin，1986；Kathal，1988；Moreno，1985；Niedz，1989)相比而言，报道较少，已存在的再生体系是茎尖扩繁(Liu，2004)和子叶结再生体系(Xu，2007)，但存在再生频率低、培养周期长等缺点。

胚芽作外植体，其优越性在于再生频率高、培养周期短、受外界环境和生理状态影响小、结果较易重复等。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种再生频率高、培养周期短的黑籽南瓜胚芽离体培养不定芽诱导植株再生的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

黑籽南瓜离体培养获得再生植株的方法，包括外植体的获得、不定芽的诱导、不定芽的伸长、生根培养、移栽步骤，其特征在于：所述不定芽的诱导培养基为MS+3％重量的蔗糖+0.9％重量的琼脂+0.5mg/L噻苯隆；所述不定芽的伸长培养基为MS+3％重量的蔗糖+0.9％重量的琼脂+0.25mg/L激动素；所述生根培养基为MS+3％重量的蔗糖+0.9％重量的琼脂+0.1mg/L吲哚乙酸；所述各种培养基的pH均为5.8；所述外植体的获得、不定芽的诱导、不定芽的伸长、生根培养阶段的培养条件为培养温度25℃±1℃。

所述外植体是通过以下方法获得的：将黑籽南瓜种子去壳后，70％乙醇(体积份数)表面消毒30秒，无菌水清洗一次，0.1％(w/v)的氯化汞消毒5分钟，然后用无菌水清洗5次；消毒的种子在黑暗中浸泡过夜后，接种到1/2MS培养基上催芽，光周期为8h黑暗/16h光照；3天后分开两片子叶，挑取两片子叶基部的凸出部位，获得胚芽，即为外植体，必要时可在解剖镜下剥离胚芽。

所述移栽的步骤为：生根培养30天后，选生根良好的植株小苗，在培养瓶中注入1/3体积的水，敞开培养瓶盖在培养架上放置2天后，用水轻轻的洗去琼脂(原培养基中的琼脂)，移栽到带有灭菌土的沙：土体积比为1∶1的塑料钵中，用塑料袋罩上移栽苗用于保湿，每隔3天浇一次MS液体培养基，2星期后去掉塑料袋，在土培养环境中适应2周。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明以黑籽南瓜胚芽作为外植体，取材方便，受外界环境和生理状态影响小，结果重复性好；

2、在MS+0.5mg/L TDZ的诱导培养基上，诱导培养再生频率高，达100％；每个外植体产生的不定芽数量多，成簇发生；

3、切除伸长芽后可继续大量生成新的不定芽，不定芽的发生具有一定的持续性。

本发明克服了目前在黑籽南瓜植株再生培养中的再生频率低、培养周期长等缺点，建立了高频不定芽再生体系的技术，为黑籽南瓜的无性繁殖和农杆菌介导的黑籽南瓜遗传转化提供了有效的实用技术，具有一定的意义。

附图说明

图1为剥离后的胚芽与胚芽周围的幼嫩组织示意图；

图2为不定芽的诱导示意图；

图3不定芽的萌发示意图；

图4为不定芽的伸长示意图；

图5为生根后的植株示意图；

图6为移栽后的再生植株示意图。