[发明专利]一种利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法

权利要求书

1.一种利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法，其步骤包括：

(1)一种环境诱导型表达质粒的构建；

(2)聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒的构建；

(3)获得产聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌；

(4)发酵重组大肠杆菌生产聚羟基脂肪酸酯并检测；

其特征是：步骤(1)所述环境诱导型表达质粒的构建方法是以大肠杆菌MG1655、JM109、W3110、DH5α或XL1-blue基因组为模板，通过设计引物PCR体外扩增环境诱导片段并将其命名为EPI；将EPI作为启动子插入到质粒pBluescript SK^-、pUC19、pUC18、pCL1920或pTrc99A中，取代原来的启动子序列，获得重组环境诱导型表达质粒；步骤(2)所述聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒的构建的方法是将来源于真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phbCAB克隆至环境诱导型表达质粒中，获得聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒pEPI-phbCAB；步骤(3)所述获得产聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌的方法是将聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒转化大肠杆菌MG1655、JM109、W3110、DH5α或XL1-blue，获得产聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌；步骤(4)所述发酵重组大肠杆菌的发酵条件为：温度设为30～40℃，摇床转速设为150～300转/分，发酵时间36h～72h；发酵培养基组成为Na₂HPO₄ 6g/L、KH₂PO₄ 3g/L、NaCl0.5g/L、NH₄Cl 1g/L、酵母浸出物2g/L～4g/L、MgSO₄ 2mmol/L、CaCl₂0.1mmol/L、葡萄糖 10g/L～30g/L；

上述环境诱导片段EPI含有P_rpoS及P_rpoS下游的受DsrA调控的序列；其以大肠杆菌MG1655或W3110的基因组为模板，以pEPI primer 1和pEPI primer 2为引物，PCR体外扩增获得；其中，所述pEPI primer 1和pEPI primer 2分别是：

pEPI primer 1：5′-AATACATGTCCATACGCGCTGAACGTTGGTCA-3′

pEPI primer 2：5′-ATACCCGGGAAGGTGGCTCCTACCCGTGATCCCT-3′。

2.根据权利要求1所述利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征是：步骤(1)所述EPI作为启动子插入到质粒pBluescript SK^-中的PscI酶切位点与SmaI酶切位点之间，获得重组环境诱导型表达质粒pEPI。

3.根据权利要求1所述利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征是：步骤(3)所述聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒转化大肠杆菌DH5α，获得产聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌DH5α/pEPI-phbCAB。

4.根据权利要求1所述利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征是：步骤(4)所述发酵重组大肠杆菌的发酵条件为：温度设为37℃，摇床转速设为250转/分，发酵时间44h～48h。

5.根据权利要求1所述利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征是：步骤(4)所述发酵培养基组成为Na₂HPO₄ 6g/L、KH₂PO₄ 3g/L、NaCl 0.5g/L、NH₄Cl1g/L、酵母浸出物2g/L、MgSO₄ 2mmol/L、CaCl₂ 0.1mmol/L、葡萄糖20g/L。