[发明专利]DL－泛内脂拆分酶固体发酵生产方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种DL-泛内脂拆分酶固体发酵生产方法，属于生物化工发酵技术领域。

(二)背景技术

D-泛酸钙生产过程中用到的DL-泛内脂拆分酶，目前只有通过液体深层通风发酵方式，经微生物自身积累而获得。液体深层通风发酵需要对发酵液进行高温高压蒸汽消毒，之后对发酵液进行降温后接入菌种通风搅拌进行发酵。该方法蒸汽消耗量大，燃煤用量大，搅拌和通风培养时间长，电耗也高，并且发酵后污水排放量大，在泛酸钙产品的生产中，污水处理费用高，难度大。

(三)发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种生产控制简单、消耗能源少的DL-泛内脂拆分酶固体发酵生产方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种DL-泛内脂拆分酶固体发酵生产方法，其特殊之处在于：包括如下步骤：

1)通过对菌种采集地点，添加D-泛酰内脂底物和1％-5％的营养基进行野化培养，将采集到的样品进行筛选得到的原始菌种镰孢霉菌(Fusari umsp.SW9)，对原始菌种进行物理和化学方式的诱导，经反复驯化，使之成为适宜于固体培养基发酵方式的菌种D-泛解酸内酯的高产菌株串珠镰孢霉菌(Fusarium moniliforme)；

2)发酵培养基中主要成分的比例如下：淀粉、浓玉米浆、酵母膏、蛋白胨的重量比例为：(1～3)∶(35～45)∶(1～2)∶(1～2)，混合均匀后调节酸度为(5.5～7)；用蒸汽喷射器对器物用具进行灭菌后，用浓浆泵将料液泵入蒸汽喷射器，控制温度105～120摄氏度，对料液进行灭菌，经过维持罐维持料液温度，然后进行闪急冷却降温，料液凝固得到凝胶状无菌固体培养基；

3)对摊盘均匀的无菌固体培养基进行适量菌种接种，在无菌发酵房内进行发酵生产，起始温度30摄氏度，用时25～35个小时，不用无菌通风，中期温度28摄氏度，用时25～35个小时，适量通风，等到菌丝体长透整个摊盘后，进行持续降温，待到菌丝体自身湿度降低，干度增加，水分不大于60％时，收菌丝体。

本发明所用串珠镰孢霉菌(Fusarium moniliforme)为一公知已知菌，具有D-泛解酸内酯水解酶的微生物种属，从发酵生产中收集及实验室筛选改良获得。其特征：在固体培养基上，该菌落圆形，产生大量棉絮状白色气生菌丝，培养基底面呈现淡紫色。显微镜下观察涂片：丝状菌丝体，有隔膜，较多小型孢子，椭圆形，多单生。

本发明区别于液体发酵模式的固体培养基发酵生产方法，用淀粉代替原来培养基中的蔗糖或葡萄糖，对培养基用蒸汽喷射器进行加热喷射糊化，冷却得到无菌凝胶状固体发酵培养基，然后进行菌种接种和控制培养得到足量菌丝体，最终获得DL-泛内脂拆分酶。

本发明生产控制简单，发酵过程中水的用量减少60％以上，发酵灭菌降低一半蒸汽消耗，发酵燃煤用量大幅降低，发酵污水排放量为原来35％，菌丝体发酵用电量为原来的55％，生产成本有一定程度的降低，本发明创新的生产工艺具有很好的应用前景。

(四)具体实施方式

实施例1：

该实施例区别于液体发酵模式的固体培养基发酵生产方法，用淀粉代替原来培养基中的蔗糖或葡萄糖，对培养基用蒸汽喷射器进行加热喷射糊化，冷却得到无菌凝胶状固体发酵培养基，然后进行菌种接种和控制培养得到足量菌丝体，最终获得DL-泛内脂拆分酶。其具体实现过程为：

1)通过对菌种采集地点，添加适量的D-泛酰内脂底物和5％的营养基(玉米浆1.5％，葡萄糖1.5％，蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，尿素0.5％)进行野化培养，将采集到的样品进行筛选得到的原始菌种镰孢霉菌(Fusariumsp.SW9)，对原始菌种进行物理和化学方式的诱导，经反复驯化，使之成为适宜于固体培养基发酵方式的菌种串珠镰孢霉菌(Fusarium moniliforme)，该菌种有别于原生菌，筛选得到的生产用菌酶活高，生物量高；

2)发酵培养基中主要成分的比例如下：淀粉、浓玉米浆、酵母膏、蛋白胨的比例为：4∶80∶2∶2，混合均匀后调节酸度为6.5。用蒸汽喷射器对器物用具进行灭菌后，用浓浆泵将料液泵入蒸汽喷射器控制温度不低于108摄氏度，对料液进行灭菌，料液的流量和压力要控制均衡、稳定，经过维持罐维持料液温度，然后进行闪急冷却降温，料液凝固得到凝胶状无菌固体培养基。