[发明专利]表达嗜热子囊菌光孢变种基因Mn－sod的毕赤酵母工程菌株

说明书

(一)技术领域：

本发明涉及生物工程，具体地说是一种表达嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)热稳定锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因Mn-sod的毕赤酵母工程菌株Pichia pastoris MS18。

(二)背景技术：

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)(EC.1.15.1.1)系一类金属酶，广泛存在于生物体中。它能够催化超氧阴离子发生歧化反应，从而清除超氧阴离子。在生物体防御氧化损伤的过程中，发挥着重要作用。目前SOD主要用于炎症、肿瘤辐照病人、自身免疫系统疾病、某些心血管疾病等方面的治疗。据报道SOD在防衰老、防细胞损伤以及防止癌发生方面也起到了重要的作用。在治疗肾细胞癌方面，Mn-SOD可以有效的降低癌瘤带来的损害，在治愈胰腺癌方面，Mn-SOD的超表达可以抑制胰腺癌的发展。Mn-SOD在抑制视网膜病及糖尿病心肌病致病机理方面发挥着重要作用。

嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)是一种分布广泛、生长上限温度较高的真菌。它能够产生热稳定的具有重要价值的SOD酶，但是野生菌用于大规模的工业生产SOD酶，还存在一些尚未解决的问题。如嗜热菌培养条件比较苛刻，嗜热酶的大规模发酵生产需要特殊设备，而且产酶效率低，从而造成产品成本增加，因此限制了它的应用。解决这一问题的有效途径是应用分子生物学手段，将热稳定SOD酶基因导入中温型微生物酵母中高效表达，利用酵母生长快、易于培养等特点，使SOD酶基因在常温和短时间内快速、大量表达，期望达到降低能耗和提高经济效益的目的。

(三)发明内容：

本发明从嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)获得SOD酶基因的全长cDNA，命名为Mn-sod(EF428323)，并将Mn-sod构建到表达载体pPIC9K上，转化毕赤酵母GS115菌株，获得毕赤酵母工程菌株MS18。

利用获得的嗜热子囊菌光孢变种Mn-sod基因，构建重组表达质粒载体pPIC9K/Mn-sod，利用电转仪提供的优化参数进行电击转化Pichia pastorisGS115，在MD和MM培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行诱导表达。获得一重组子MS18。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在30℃ 250rpm/min摇床培养7d后，酶表达量为0.92mg/mL，酶活为2324U/mL，分子量为86.0kDa，酶在50，60℃下活性稳定，80℃保温40min后酶活仍剩余50％，在90℃处理60min仍具有20％的活性。

该工程菌株MS18能够高效表达(0.92mg/mL，2324U/mL)嗜热子囊菌光孢变种Mn-SOD酶基因Mn-sod，分泌的Mn-SOD酶具高的热稳定性，用于热稳定Mn-SOD酶的生产菌株，有重要的经济价值和社会价值。

(四)附图说明：

图1表达嗜热子囊菌光孢变种基因Mn-sod的毕赤酵母工程菌株程序图

是嗜热子囊菌光孢变种的分离鉴定

是嗜热子囊菌光孢变种Mn-SOD酶基因Mn-sod的克隆

是基因Mn-sod表达载体的构建

是表达基因Mn-sod的酵母工程菌株的构建及筛选

是毕赤酵母Pichia pastoris GS115的诱导表达和活性检测

是表达嗜热子囊菌光孢变种基因Mn-sod毕赤酵母工程菌株MS18的保藏

图2Mn-sod基因PCR产物电泳图谱

泳道1：Marker-DL2000

泳道2：全长cDNA(分子量878bp)

图3Mn-SOD酶的SDS-PAGE分析

a)泳道M：低分子量蛋白标准

泳道1：对照

泳道2-7：酵母工程菌Pichia pastoris MS18的诱导2-7天

b)泳道M：低分子量蛋白标准

泳道1：纯化的重组Mn-SOD酶(分子量21.7kDa)

(五)具体实施方式

1、嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)的分离鉴定

(1)标本采集：从堆肥中采集，地点北京。

(2)分离培养：将采集标本取0.5克放置在PDA平板上50℃培养3天后，进行分离纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson(1964)文献。