[发明专利]一种检测广州管圆线虫病的金标试剂盒和制备方法

权利要求书

1、一种检测广州管圆线虫病的金标试剂盒，其外包装主要由加样孔(2)和观察孔(3)顺次分布于检测板(1)上，其检测板(1)特征在于：在PVC垫板(10)的两端分别设有样品端吸水垫(4)和末端吸水垫(9)，在PVC垫板(10)中部设有硝酸纤维膜检测层(6)，在硝酸纤维膜检测层(6)与样品端吸水垫(4)交接处设有包被金标标记抗广州管圆线虫单克隆抗体的金标垫(5)，此金标垫(5)分别与样品端吸水垫(4)和硝酸纤维膜检测层(6)叠连相接，在离接口不远处的硝酸纤维膜检测层(6)上设有检测线(7)和质控线(8)，在检测线(7)和质控线(8)上分别包被有抗广州管圆线虫单克隆抗体和羊抗鼠IgG或IgM。

2、如权利1所述的一种检测广州管圆线虫病的金标试剂盒，其特征在于所述单克隆抗体为两种针对广州管圆线虫成虫抗原上不同决定簇的抗广州管圆线虫单克隆抗体。

3、如权利1所述的一种检测广州管圆线虫病的金标试剂盒的制备方法，包括下列步骤：

A、广州管圆线虫可溶性抗原的制备：

从褐云玛瑙螺或福寿螺体内分离广州管圆线虫3期幼虫，按80～100条/只的量人工感染SD大鼠，33～35天后从鼠肺动脉中分离得广州管圆线虫成虫，生理盐水漂洗后冰冻干燥，研磨成粉，冷丙酮脱脂2～3次，经超声粉碎后反复冻融，14000rpm 4℃离心20min，上清液即为广州管圆线虫可溶性抗原，-20℃保存待用。

B、抗广州管圆线虫单克隆抗体的制备和纯化：

用广州管圆线虫成虫蛋白免疫小鼠后，取免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合，用广州管圆线虫成虫抗原进行筛选，得到针对广州管圆线虫成虫的单克隆细胞株，将此细胞注入小鼠腹腔生产出大量的单克隆抗体，用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化得到IgG类单克隆抗体，对于IgM类单抗，对于IgM类单抗，则用优球蛋白沉淀法，该法适用于IgM和IgG₃型单抗的提取，所获制品的抗体活性几乎保持不变。

C、胶体金的制备：

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，在烧瓶加入1000ml双蒸水和10ml1％氯金酸，加热至沸腾，加入20ml 1％柠檬酸三钠，继续煮沸约10～20min，直到液体呈亮红色，将烧杯置于室温，水浴中冷却，冷藏保存；

D、胶体金标记抗体的制备：

将胶体金和抗体分别以0.1Mol/L K₂CO₃调pH至7.4，在胶体金溶液中按20～80μg/ml加入抗广州管圆线虫单克隆抗体，电磁搅拌30mi n后加入5％胎牛血清(BSA)，使溶液中BSA终浓度为1％，以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀，静置后先1200～1800r/min低速离心20min，弃去凝聚的沉淀，接着6000～14000g 4℃离心1h，吸出上清，将沉淀用含1％BSA和0.02％NaN₃的Tris-HCl缓冲液重悬为原体积的1/10，4℃保存；

E、金标垫的制备：

用二维喷动仪将标记好胶体金的抗广州管圆线虫单克隆抗体均匀地喷在玻璃纤维膜上，喷液量为0.8～2.0μl/cm，37℃烘干过夜，封袋备用；

F、硝酸纤维膜检测层中检测线和质控线的制备：

调试二维喷动仪，将浓度为0.8～1.5mg/ml的抗广州管圆线虫单克隆抗体用1～3％的甲醛固定后，均匀地喷在硝酸纤维膜中段，得到检测线(7)；用1～3％的甲醛固定浓度为2～2.5mg/ml的羊抗鼠IgG或IgM后，均匀地喷在硝酸纤维膜上，距离检测线0.5～1cm处得到质控线(8)，喷液量均为0.8～2.0μl/cm，37℃烘干过夜，封袋备用。

G、广州管圆线虫金标快速诊断试剂盒的组装与包装：

将样品端吸水垫(4)、金标垫(5)、硝酸纤维膜检测层(6)、末端吸水垫(9)粘贴在PVC垫板(10)上，用切条机将试纸裁剪成6～8cm长、3～5mm宽规格试纸条，将试纸条装入广州管圆线虫金标检测板内，加样孔(2)正对样品端吸水垫(4)，观察孔(3)正对硝酸纤维膜检测层(6)。将试纸条与干燥剂封装在铝箔袋内，4～30℃避光保存，切勿冻存。铝箔袋打开后应尽快使用试纸条，受潮后试纸条将失效。