[发明专利]一组特异识别金黄色葡萄球菌的寡核苷酸适配子及其应用

说明书

发明领域：

本发明涉及一组特异识别金黄色葡萄球菌的寡核苷酸适配子的获得以及这些寡核 苷酸适配子在鉴别金黄色葡萄球菌中的应用。

背景技术：

细菌是临床疾病常见的致病因素，严重的威胁着人类健康。如何快速、灵敏鉴别 重要致病微生物的类型、性质，是世界各国投入大量人力物力加以研究的重大课题。 传统检测病原菌的方法往往是需要先分离病原微生物，然后通过微生物培养，再用经 典的方法鉴定。耗时、不灵敏是这些方法普遍存在的问题。发展快速、灵敏检测病原 微生物的技术十分必要，特别是在预防生物恐怖袭击方面更显迫切。利用抗体虽然能 够特异识别病原细菌，能够迅速、准确的对待检标本作出鉴定，但该技术受特异性抗 体制备难度的制约。因为按照伯杰分类标准，生物学形状基本相同的细菌群体构成一 个菌种，性状相近关系密切的若干菌种组成一个菌属。从本质上讲，同一菌属所含的 表面抗原绝大多数是相同的，只有细微的差别。找到这些差别并制备特异性抗体显然 是一项耗时而艰巨的任务。

近些年来，寡核苷酸适配子作为抗体分子的前景性替代分子，其研究较为引人注 目。寡核苷酸适配子是由SELEX技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)生物文库技术筛选获得的，该技术的原理就是利用分子生物 学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其随机序列长度在20-100个碱基左 右。利用单链寡核苷酸分子构像灵活多变的特性，将随机寡核苷酸文库与靶分子相互 作用，保留以空间构像与靶分子结合的寡核苷酸，经反复扩增、筛选数个循环，即可 使与该靶子特异结合的寡核苷酸序列得到富集，最终获得多种靶分子的特异寡核苷酸 适配子，即aptamer。利用SELEX技术筛选获得的aptamer识别分子的模式与蛋白抗体 类似，但与蛋白类抗体相比，核酸类配基具有更多的优越性，如不受免疫条件和免疫 原性限制，可体外人工合成，变性与复性可逆，可修饰并有利于长期保存和室温运输 等。更重要的是，aptamer比抗体具有更高的特异性，甚至能识别单抗不能区分的蛋白 质分子。而且aptamer的靶分子非常广泛，小至染料分子，大至完整的病毒颗粒和细菌 病原体，甚至完整的细胞也可以通过消减SELEX技术筛选出高亲和力的寡核苷酸适配 子。

与经典的SELEX技术相比，消减SELEX技术的一个显著的特点是筛选前无需明确 靶标成分的特性，如分化标志(Wang C，et al.J Biotechnol；2003:102：15-22)， 因此，即便在细菌特异抗原未知的情况下，也有可能获得该细菌特异抗原成分的寡核 苷酸适配子。近年来确有一些研究人员利用SELEX技术筛选到了与细菌特异性结合的 aptamer，说明特异性的aptamer在微生物的检测及致病微生物的治疗方面具有潜在的应 用价值。但由于同一细菌在不同的状态下很容易发生变异，这种情况下利用单一标志 物进行鉴定常常会导致对该菌的漏检(假阴性)，而利用一组针对同一细菌上不同靶分 子的aptamer进行检测，在理论上可大大提高靶细菌检出的敏感性和特异性。

基于以上考虑，本发明以临床上常见的金黄色葡萄球菌为目的靶细菌，同时以链 球菌和表皮葡萄菌属为消减靶细菌，利用细菌消减SELEX技术获得了五条金黄色葡萄 球菌特异的aptamer，组合应用能够迅速、敏感、特异的检测到金黄色葡萄球菌。由于 单链DNA寡核苷酸适配子性能稳定、合成方便且廉价、经修饰后可直接用于荧光或化 学发光、发色方法检测靶细菌，因此操作简单、直接。该发明可以在临床医学、军事 医学及应急防护中得到广泛应用。

发明内容：

本发明目的在于提出特异识别金黄色葡萄球菌的五条寡核苷酸适配子的序列及其 应用，包括快速检出样品中的金黄色葡萄球菌，鉴别金黄色葡萄球菌与其它革兰氏阳 性球菌方面的应用。。

本发明优点：

1)与蛋白类的抗体相比，单链的寡核苷酸更加稳定；aptamer可直接体外合成、标 记，因此不需要标记的二抗，使得操作更为简单、迅速；aptamer的合成成本较抗体制 备成本低，周期短。

2)该五条序列均能分别特异识别金黄色葡萄球菌表面不同靶子。

3)与单一序列相比，该五条序列联合应用，能够提高对金黄色葡萄球菌的敏感性 和特异性，提高对靶细菌的检出率。

附图说明：

图1五条寡核苷酸适配子特异性识别金黄色葡萄球菌的共聚焦结果图。