[发明专利]琥珀酸放线杆菌菌种改组、选育方法以及用其发酵生产丁二酸的方法

说明书

技术领域

本发明属生物工程技术领域，具体涉及一株具有较强钠离子耐受性和产酸性能的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC2653(即F3-10)，该菌株的选育方法及该菌株应用于厌氧发酵生产丁二酸的方法。 

背景技术

丁二酸，又称琥珀酸(succinic acid)，分子式为C₄H₆O₄，分子量为118.09，是一种常见的天然有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。丁二酸是工业上一种重要的四碳化合物，它作为有机合成原材料，中间产物，以及专业化学制品广泛应用于食品、医药、农药、染料、香料、油漆、塑料和材料工业。目前，丁二酸和它的大多数衍生物的生产还处在进一步研究和开发阶段。 

丁二酸的生产可通过化学合成方法或者发酵方法来进行，用微生物发酵碳水化合物生产丁二酸的方法日益受到人们的重视。由于发酵法生产丁二酸是以可再生糖源(如葡萄糖)和二氧化碳作为主要原料，因此微生物发酵法生产丁二酸，具有成本低和不依赖石化原料的优点，而且能利用二氧化碳，更加显示了环境友好特征。 

丁二酸是许多严格厌氧菌和兼性厌氧菌代谢的重要中间产物。本研究室从牛瘤胃中筛选得到一株产丁二酸菌株，经鉴定为琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenesCGMCC1593。已有研究表明，钠离子浓度对丁二酸产生菌如Anaerobiospirillumsucciniciproducens等的生长和产酸具有一定的影响。同时，Na⁺在跨膜pH梯度、细胞渗透压和胞内pH调控中都起着重要的作用。据Lee等人报道，在Anaerobiospirillum.succiniciproducens发酵过程中，当NaCl浓度超过4.0g/L时，菌体的最高浓度(OD₆₆₀)呈现出明显的下降趋势，同时丁二酸的产量也随之下降。原因可能是钠离子所造成的高渗环境对菌株具有一定的毒害作用，抑制了菌体的生长和产酸。在前期研究中，我们也发现Actinobacillus succinogenes CGMCC1593发酵过程中，采用NaOH或Na₂CO₃控制发酵pH时，产酸受到抑制；而采用MgCO₃缓冲发酵过程中pH时则效果较好。但是MgCO₃的价格高，且使用时灭菌不方便，这对发酵法生产丁二酸的工业化非常不利，所以筛选一株耐钠离子菌株有重要意义。 

基因组改组技术是一种新的体内分子育种方法。这种技术是分子定向进化在全基 因组水平上的延伸，它将重组的对象从单个基因扩展到整个基因组，可以在更为广泛的范围内对菌种的目的性状进行优化组合。基因组改组最大的优点就是可以在菌株的基因型和表型的相关机制不是很清楚的情况下，通过多轮循环的基因改组就可以迅速将决定某一理想表型的多个甚至十几个突变基因组合在一起而达到菌种改进的目的。微生物的环境耐受性，如耐酸性、抗热性等表型的基因编码机制现在尚不完全清楚，直接采用基因工程技术很难将分散在基因组上的由多个基因控制的性状进行改造；而传统诱变的正向突变率很低，改良一个菌种所需的筛选量大，筛选时间长。因此，应用基因组改组技术进行菌种选育，快速获得具有较强钠离子耐受性和产酸性能的丁二酸生产菌株，并用其发酵生产丁二酸的方法具有重要的现实意义。 

发明内容

本发明的目的是提供一种具有较强钠离子耐受性和产酸性能好的琥珀酸放线杆菌，提供一种该菌株的选育方法及利用该菌株厌氧发酵生产丁二酸的方法。 

本发明的技术方案：以本实验室自主筛选的丁二酸产生菌琥珀酸放线杆菌CGMCC1593为出发菌，对其进行诱变，将筛选得到几株发酵性能有改良的突变株作为母本菌株进行基因组改组，选育高产耐钠菌株，并研究该菌株在流加Na₂CO₃控制发酵pH条件下厌氧发酵生产丁二酸。 

一株厌氧发酵生产丁二酸的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes菌株CGMCC2653。 

获得琥珀酸放线杆菌CGMCC2653的基因组改组方法，包括以下步骤： 

a)菌种诱变：以琥珀酸放线杆菌CGMCC1593作为出发菌，将其单细胞悬浮液分别进行X-射线诱变、紫外线诱变、EMS化学诱变及NTG诱变，筛选得到产酸和耐钠离子性能有改良的三株菌株，X-8、UV-17、SE-6和氟乙酸钠抗性的高产菌株SF-9；