[发明专利]结核分枝杆菌融合蛋白的构建及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及融合蛋白的构建领域。

背景技术

全球约1/3人口被结核感染，90％以上处于潜伏状态。减毒牛型结核分枝杆菌-卡介苗(Bacille Calmette-Guerin，BCG)对预防儿童严重的结核感染有效，然而对成人肺结核几乎没有保护作用，因此亚单位疫苗增强免疫策略对于提高成人肺结核免疫保护水平具有重要的意义^[1-4]。以往结核亚单位疫苗研究主要选择生长早期和对数生长期表达的抗原，忽略了休眠期细菌特有的抗原。然而，休眠状态结核杆菌在人体内是普遍存在的。感染机体的结核杆菌可能有处于休眠状态的结核杆菌。结核杆菌被巨噬细胞吞噬后，受到天然免疫物质NO等的攻击，可能转入休眠状态。处在结核结节低氧环境中的细菌，也大多转入休眠状态。休眠状态的结核杆菌潜伏感染是成人肺结核复发的主要来源。BCG免疫机体后，由于休眠期抗原表达量低，不能针对休眠期细菌产生免疫反应，导致对休眠状态结核杆菌没有免疫保护。然而在与结核病患者密切接触的健康人群中，发现对休眠期抗原存在很强的免疫应答。基于上述研究，建立对休眠期细菌的免疫应答对控制成人结核病发生具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结核分枝杆菌融合蛋白的构建及其应用方法，尤其是在结核亚单位疫苗中的应用。

随着人们对潜伏感染的认识，休眠期结核杆菌表达的抗原物质开始受到重视。休眠期结核杆菌为了适应缺氧等恶劣生存环境部分基因表达上调。在低氧和NO作用的环境中，休眠相关DosR调节子(包括48个基因)和HspX(α-crystallin)基因表达上调。部分上调表达的因子有抗原性。其中，HspX抗原可以被致敏的T细胞识别，刺激T细胞分泌IFN-γ，具有细胞免疫和体液免疫原性。在健康的与肺结核密切接触的家人(80％)和医务工作者(90％)中，HspX具有明显的T细胞刺激活性，比例明显高于普通人群(50％)，提示HspX抗原具有免疫保护作用。

Ag85B属于结核杆菌抗原85复合体家族成员。该家族是结核杆菌短期培养物的滤过蛋白质(short-term culture filtrates，ST-CF)中的主要分泌性蛋白质，已证实是重要的结核杆菌免疫保护性抗原。Mpt64是结核杆菌的分泌性蛋白质，也是结核杆菌ST-CF中的主要成分，可以占到结核杆菌培养基上清滤过液中蛋白质总量的8％，其第190～198为多肽片段H-2D(b)限制性的CD8⁺T细胞表位。

为了实现上述目的，本发明提供了结核分枝杆菌融合蛋白包含保护性抗原HspX；一段为CD8⁺T细胞表位Mpt64的190-198位的氨基酸多肽；以及结核杆菌抗原85复合体Ag85B。

本发明的结核分枝杆菌融合蛋白为Ag85B-Mpt64^190-198-HspX，简称为AMH。

为了更方便的使用AMH，将AMH与佐剂混合构建亚单位疫苗。

其中佐剂为二甲基三十六烷基铵(DDA)为基础的复合佐剂(含卡介苗多糖核酸，BCG-PSBN)。

该结核分枝杆菌融合蛋白以包涵体的形式存在。

该结核分枝杆菌融合蛋白能在大肠杆菌中稳定表达，并能用Ni-NTA介质纯化。

AMM融合蛋白疫苗是我们已经构建的融合蛋白疫苗，所选抗原为结核分枝杆菌的保护性抗原物质Ag85B、MPT64_190-198、Mtb8.4，并将三者串连表达。我们的研究表明AMM融合蛋白在佐剂DDA-BCG PSN辅助下能够诱导较强的体液免疫和细胞免疫反应，并且诱导以Th1型细胞免疫为主的免疫反应，是有潜力的抗结核候选疫苗。为了进一步加强对休眠期细菌的免疫保护水平，我们用HspX替换Mtb8.4构建了新的融合蛋白AMH，并通过特异性细胞免疫和体液免疫的检测，比较评价AMH融合蛋白的免疫活性。

本发明的有益效果：

1、本申请筛选休眠期保护性抗原，将休眠期抗原、对数生长期抗原联合使用，试图建立针对结核杆菌不同生长状态菌群的免疫反应，从而有效清除或监视包括潜伏感染在内的各类结核杆菌，预防成人结核病的发生。

2、本发明选用抗原Ag85B、Mpt64_190-198、HspX，构建融合蛋白，以克服单一抗原免疫原不足的缺点，同时建立对生长期和休眠期细菌全面的免疫力。