[发明专利]花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶基因及其编码的蛋白质以及基因克隆方法

说明书

技术领域

本发明属于脂肪酸代谢工程领域，具体涉及花生硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶基因及其编码的蛋白质以及基因克隆方法。

背景技术

植物硬脂酰-载体蛋白脱饱和酶(SAD)，催化硬脂酰-载体蛋白脱饱和反应，在脂肪酸链的C9-C10间引入一个双键形成油酰-载体蛋白。油酰基运出质体可进一步脱饱和形成多不饱和脂酰基，这些脂酰基可形成甘油脂等，成为生物膜的组成成分，或贮存起来成为贮脂。因为多不饱和脂肪酸的形成主要以油酰基的脱饱和为基础，所以SAD催化的脱饱和作用是植物典型不饱和脂肪酸生物合成的第一步，在很大程度上决定饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例(罗通，邓骛远，张富丽.植物硬脂酰一酰基载体蛋白脱饱和酶[J].生命的化学，2006)。研究表明，这一比例和生物膜系统的流动性、选择透性以及植物的多种生理功能有密切的关系，并决定着贮脂的成分和含量(Los D A，Murata N.Structure andexpression of fatty acid desaturases.Biochimiea et Biophysica Acta，1998，1394：3-15)。

SAD的结构分析：对红花(Carthamus tinctorius)中分离纯化到的SAD进行分析，推断SAD是一个同源二聚体；Lindqvist等用X-射线晶体衍射分析描述了蓖麻SAD的晶体结构。亚基的二级结构除了在其C末端有一个“发夹环”外，主要由11个α螺旋组成一个较大的螺旋结构区。该蛋白主要由4个螺旋束结构组成，中间埋藏着一个由两个铁原子组成的二铁中心，两铁原子之间通过一个氧原子相联，形成非常对称的Fe-O-Fe二铁氧簇，并主要由二铁中心及四螺旋束的氨基酸侧链形成酶活性中心，金属铁离子在打断脂肪酸链上的稳定的C-H键时起重要作用(Lindqvist Y，Huang W，Schneider G，et al.Crystal structure of delta9stearoyl-acyl carrier protein desaturase from castor seed and its relationship to otherdi-iron proteins[J].EMBO J，1996，15(16)：4081-4092)。

SAD的功能分析：目前已经从蓖麻、大红花、油菜等多种植物中分离获得SAD的cDNA片段(张羽航，鲍时翔，郑学勤等.脂肪酸饱和酶的研究进展[J].生物技术通报，1998，4：1-8)。Kodama(Kodama H，et al.Fatty acid desaturationduring chilling acclimation is one of the factors involved in conferring lowtemperature tolerance to young tobacco leaves[J].Plant Physiology，1995，107(4)：1177-1185.)将酵母的SAD基因编码的硬脂酰基辅酶A去饱和酶导入烟草，Los等(Hightower R，et al.Expression of antifreeze protein in transgenic plants[J].PlantMol Biol.，1991，17：1013-1021.)将菠菜的SAD基因编码的硬脂酰基辅A去饱和酶导入烟草都可提高烟草的抗冻力。Los D等(Los D et al.Cloning of atemperature-dependent expression of desaturase desA gene in SynechocystiPCC6803[J].FEBS，1993，318(1)：57-60.)将SAD基因有义链或反义链插入到植物转化载体pBI121中，对基因工程的模式植物烟草进行了转化，对转基因烟草的抗寒性分析表明正向表达SAD基因的转基因烟草抗寒性明显增强，反向表达SAD基因的转基因烟草抗寒性明显减弱。由此也证明了脂肪酸去饱和酶高表达时可增强植物抗寒性。另外，SAD催化的硬脂酰载体蛋白脱饱和作用在很大程度上决定了饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例(罗通，邓骛远，张富丽.植物硬脂酰一酰基载体蛋白脱饱和酶[J].生命的化学，2006)。

但是，现有技术中没有关于花生SAD基因的报道，因此在花生SAD研究领域仍属空白。而花生的SAD基因的获得，能够为下一步花生品质改良的研究和抗寒性的研究奠定一个良好的基础。

发明内容