[发明专利]一种鉴定单亲水牛亲权关系的方法及其引物、试剂盒无效
申请号: | 200810148093.7 | 申请日: | 2008-12-29 |
公开(公告)号: | CN101509033A | 公开(公告)日: | 2009-08-19 |
发明(设计)人: | 徐亚欧;孙蕊;毛亮 | 申请(专利权)人: | 西南民族大学 |
主分类号: | C12Q1/68 | 分类号: | C12Q1/68 |
代理公司: | 成都九鼎天元知识产权代理有限公司 | 代理人: | 刘雪莲;吴彦峰 |
地址: | 610041四*** | 国省代码: | 四川;51 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 鉴定 单亲 水牛 关系 方法 及其 引物 试剂盒 | ||
1.一种鉴定单亲水牛亲权关系的方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)从普通牛种微卫星标记中,筛选出多态性丰富的微卫星引物;
(2)以待检水牛基因组DNA为模板,在筛选出的微卫星引物的引导下进行 25μL反应体系的PCR扩增;
(3)对微卫星PCR扩增片段进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测;
(4)根据电泳检测结果判断每个个体的基因型,根据基因型计算单亲亲权 指数PI值、并根据PI值计算出亲子相对概率值W值,当W值大于或等于99.73 %时,则认定假设亲代与子代个体有亲生关系,当W值小于99.73%时,则可以 认为假设亲代与子代个体不具有亲生关系;
上述微卫星引物包括以下引物:
由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的微卫星引物ETH225;
由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列组成的微卫星引物BM1818;
由序列表中序列5和序列6的核苷酸序列组成的微卫星引物INRA035;
由序列表中序列7和序列8的核苷酸序列组成的微卫星引物BM2113;
由序列表中序列9和序列10的核苷酸序列组成的微卫星引物TGLA227;
由序列表中序列11和序列12的核苷酸序列组成的微卫星引物CSRM60;
由序列表中序列13和序列14的核苷酸序列组成的微卫星引物BM2934;
由序列表中序列15和序列16的核苷酸序列组成的微卫星引物BM1862;
(5)由序列表中序列17、序列18及序列19、序列20组成线粒体D-Loop 区引物,以待检水牛基因组DNA为模板,对线粒体基因片段进行50μL反应体 系的PCR扩增,对线粒体PCR扩增片段进行琼脂糖凝胶纯化,利用双脱氧终止 法对纯化后的PCR产物进行测序,用DNAman软件分析待检样品的DNA序列一致 率,若线粒体DNA序列完全一致,则说明待检样品间存在亲缘关系。
2.根据权利要求1所述的鉴定单亲水牛亲权关系的方法,其特征在于:所 述PCR扩增的50μL反应体系包括:DNA模板2.5ng,10×PCR缓冲液5μL, 25mmol/L的MgCl2 3μL,2.5mmol/L的dNTPs 4μL,5U/μL的Ex Taq DNA聚 合酶0.50μL,20pmol/μL的上游引物1μL,20pmol/μL的下游引物1μL, 余量为灭菌蒸馏水。
3.根据权利要求1所述的鉴定单亲水牛亲权关系的方法,其特征在于:所 述50μL反应体系PCR扩增反应条件为:94℃预变性5min;94℃变性1min,55℃ 退火1min,72℃延伸1min,共35个循环;72℃延伸10min。
4.一种用于鉴定单亲水牛亲权关系的试剂盒,其特征在于:试剂盒中包含 序列表中序列1-20的引物,以及以下试剂:Ex Taq DNA聚合酶,10×PCR扩增 缓冲液,dNTPs,无菌水,10×凝胶上样缓冲液,0.5mL磷酸缓冲盐溶液,2mg/mL 蛋白酶K,10%SDS液,饱和酚,氯仿,异戊醇,70%乙醇,无水乙醇,TE溶液, 30%聚丙烯酰胺溶液,5×TBE电泳缓冲液,10%过硫酸铵溶液,NNNN-四甲基乙 二胺,含10%乙醇、0.5%冰乙酸的固定液,1%硝酸溶液,0.2%硝酸银溶液,含 1.5%氢氧化钠、0.4%甲醛的显色液,0.75%碳酸钠溶液,分子量标准物pUC18 DNA/Msp I,DNA分子量标准DL2000,核酸染料,6×凝胶上样缓冲液;所述各 种溶液的溶剂均为水。
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