[发明专利]葡萄糖异构酶突变体

说明书

本申请是申请日为2004年6月16日、申请号为200410047865.X、发明名称为“葡萄糖异构酶突变体”的中国专利申请的分案申请。

技术领域：

本发明涉及分子生物学与生物技术领域，具体地说，涉及利用基因突变技术制备高活力、或高活力并耐热的葡萄糖异构酶突变体的方法、所获得的突变体及其应用。

背景技术：

葡萄糖异构酶(Glucose isomerase，E.C.5.3.1.5，简称GI)、或称木糖异构酶(Xyloseisomerase)是戊糖发酵途径的关键酶。该酶是最重要的酶制剂之一(Kaneko，et al.，BiosciBiotechnol Biochem，64：940-947，2000)。食品工业使用该酶制备果葡糖浆。

酶法生产果葡糖浆，产品中果糖的含量取决于反应的温度。温度越高，异构反应越趋向于果糖的生成。目前商用葡萄糖异构酶主要取自密苏里游动放线菌(Actinoplanesmissouriensis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、或链霉菌(Streptomyces)。这些葡萄糖异构酶在高温(如高于65℃)下稳定性差。因此，目前工业上在60℃左右制备果葡糖浆，产物中果糖的含量也就较低，一般不超过44％。含更高浓度果糖的果葡糖浆通常依赖层析分离方法生产，由此增加了生产成本。

世界各地的科学家对从耐热菌中筛选并通过蛋白质工程的方法培育耐热、高催化活性的葡萄糖异构酶进行了许多研究。如J.G.Zeikus及其合作者从Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum、Thermotoga neapolitana等数种耐高温菌中分离并研究了耐高温葡萄糖异构酶(见Lee et al.，Journal of General Microbiology，139：1227-1234，1993；Vieille et al.，MethodsEnzymology，330：215-24，2001；Lee et al.，Journal of General Microbiology，139：1241-1243，1993；Scriprapundh et al.，Protein Engineering，13：259-265，2000；Scriprapundh et al.，Protein Engineering，16：683-690，2003；Zeikus et al.，US Patent NO5,656,497)。这些或其它来源的耐高温葡萄糖异构酶之耐热性能均不如人意，且活力较低，尚未见用于工业化生产。因此，目前仍存在高活力、或高活力并耐热的葡萄糖异构酶的需求。

发明内容：

本发明利用遗传工程和蛋白质工程技术对来源于T.saccharolyticum的葡萄糖异构酶进行改良，获得了一系列高催化活性的葡萄糖异构酶突变体，适宜生产含高果糖的果葡糖浆。

本发明的目的在于提供高催化活性的葡萄糖异构酶突变体。本发明的目的还在于提供使用本发明所述的葡萄糖异构酶突变体直接生产果糖含量等于或高于55％的果葡糖浆。本发明的目的还在于提供使用本发明所述的葡萄糖异构酶突变体生产果糖含量低于55％的果葡糖浆。

为实现本发明的上述目的，本发明人进行了大量深入的实验，通过对T.saccharolyticum葡萄糖异构酶基因进行定点突变，随后在MacConkey培养基上筛选，从而取得一系列高催化活性、或具高催化活性并耐热的葡萄糖异构酶突变体。具体而言，利用本领域已知的技术，构建含有亲本葡萄糖异构酶基因的载体质粒，然后设定定点突变的位点以及突变后的氨基酸种类，再合成适当的引物，以所述的含亲本葡萄糖异构酶基因的载体质粒为模板，PCR扩增DNA片段、装配所扩增的DNA片段以及PCR扩增全长突变基因。通过将该全长突变基因克隆到适当的载体上并转化适当的宿主细胞，经培养筛选出具有葡萄糖异构酶活性的阳性克隆。最后从阳性克隆中提取质粒DNA，进行DNA序列测定分析，以确定引入的突变。

在本发明制备葡萄糖异构酶突变体的方法中，可采用任何适当的载体。例如，适用的载体包括但不限于原核表达载体pGEMT-Easy，pRSET和pET21；包括但不限于真核表达载体pYD1和pYES2/GS；包括但不限于克隆载体pUC18/19和pBluscript-SK。

在本发明制备葡萄糖异构酶突变体的方法中，所获得的葡萄糖异构酶突变体基因可以在原核细胞或真核细胞胞内表达，也可采用本领域已知的任何其它适当方法实现在原核细胞或真核细胞胞外表达。