[发明专利]一种寡核苷酸的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种寡核苷酸的制备方法。

背景技术

寡核苷酸的基本结构单元是核苷酸，核苷酸由碱基、戊糖和磷酸组成。核苷酸可以分为核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，二者的基本化学结构相同，只是所含戊糖不同，核糖核苷酸的戊糖是D-核糖，脱氧核糖核苷酸的戊糖是D-2-脱氧核糖。碱基的种类一般包括鸟嘌呤基、腺嘌呤基、胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基。

目前广泛使用的寡核苷酸化学合成方法是固相合成法(也称作亚磷酰三酯法)。《生物化学》(第三版上册，王镜岩等主编，高等教育出版社)第520-521页介绍了固相合成的原理如下：全部反应是在一个不大的固相柱子中进行的。首先将待活化的核苷酸上的某些游离基团保护(封闭)起来，使反应按设计的方向进行。5’-OH用二对甲氧三苯甲基(DMT)保护，碱基上的氨基用苯甲酰基保护。然后对3’-OH则用氨基亚磷酸化合物进行活化。第一个核苷酸的3’-OH与固相(树脂)结合在一起，它的5’-OH与活化的单体(核苷酸)之间形成一个亚磷酸三酯，活化单体上的5’-OH和碱基上的氨基等由于受到保护而不会参与反应。在第二步反应中，亚磷酸三酯经碘氧化形成磷酸三酯；第三步反应中，加入三氯乙酸除去生长链中的5’-OH上的保护剂DMT。至此，DNA链已经延伸了一个核苷酸单元，并可投入下一轮延伸反应。按事先输入的程序，整个DNA片段合成完毕之后，用苯硫酚除去5’-OH上的保护剂DMT，用浓氢氧化铵将DNA片段与固相树脂断开，使DNA得以洗脱下来。再用浓氢氧化铵在加热条件下使碱基上的保护剂除去。最后除去氢氧化铵，在真空中抽干。

由于上述固相合成的全部过程是在固相柱子中进行的，受到固相柱子的体积所限，该方法的合成规模小、产率低，无法满足大量合成的要求。随着对核酸研究的深入，一方面在科学研究中用到的寡聚核糖核酸迅速增加，另一方面，将核糖核酸用于临床方兴未艾，因此，设计能够进行大规模合成RNA的方法意义重大。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有的寡核苷酸化学合成方法的合成规模小的缺点，提供一种能够大规模合成寡核苷酸的制备方法。

本发明提供了一种寡核苷酸的制备方法，其中，该方法包括在缩合反应条件下将式(1)的化合物与式(2)的化合物在液态反应介质中反应，得到式(3)的化合物，

式(1)                                    式(2)

式(3)

其中，R₁表示DMTr(二对甲氧三苯甲基)、RNA或DNA；

R₂和R₃各自表示位阻型硅烷保护基团；

R₄表示卤素原子；

A⁺表示三烷基铵离子；

B₁和B₂各自表示N-酰基取代的鸟嘌呤基、腺嘌呤基、胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基。

本发明的方法中采用适当的保护基保护相应的官能团，只裸露出式(1)的化合物的需要连接的5’端羟基和式(2)的化合物的需要连接的3’端磷酸盐，在液态反应介质中进行缩合反应，连接OH-组分和P-组分，得到DNA或RNA短链。如果需要的话，在这个步骤完成之后，可以脱除新得到的DNA或RNA短链5’端的保护基，再次和新的式(2)的化合物进行缩合反应，即得到较长的链，重复进行这样的几步反应，最后脱除所有的保护基，即得到要具有所需长度的寡核苷酸；或者，可以脱除新得到的DNA或RNA短链3’端的保护基，然后将3’端羟基磷酸酯化得到新的P-组分(如反应式III所示的反应)，再次和新的式(3)的化合物进行缩合反应缩合，即得到较长的链，重复进行这样的几步反应，最后脱除所有的保护基，即得到要合成的寡核苷酸。本发明的方法不需要使用固相柱，可以在液态反应介质中进行，因此能够大规模合成寡核苷酸。

具体实施方式

本发明提供的寡核苷酸的制备方法包括在缩合反应条件下将式(1)的化合物与式(2)的化合物在液态反应介质中反应，得到式(3)的化合物，

式(1)                                              式(2)

式(3)

其中，R₁表示DMTr(二对甲氧三苯甲基)、RNA或DNA；

R₂和R₃各自表示位阻型硅烷保护基团；