[发明专利]产皂甙元的盾叶薯蓣内生菌的筛选方法

说明书

本发明涉及一种生产菌种，其是由盾叶薯蓣中分离得到的，并能产生皂甙元。 

背景技术

盾叶薯蓣是一种药用植物，传统中医学认为，盾叶薯蓣以根茎入药，其性味苷、苦、凉。具有祛湿、清热解毒之功效，民间用于治疗皮肤急性化脓性感染、软组织损伤、蜂蛰、虫咬及各种外科炎症，根状茎还有强身壮骨的作用。近年来的研究表明，薯蓣有抗炎、抑菌、平喘、降血脂等作用。皂甙元是薯蓣的主要活性成分，也是我国由于合成多种甾体激素的重要前体，可以合成蛋白同化激素、皮质激素、性激素等三大类数百种甾体激素药物，是国内药品生产中仅次于抗菌素的一个重要领域。 

我国目前生产皂甙元的方法主要是从盾叶薯蓣中直接提取。而随着医药工业对皂甙元的需求量日益增加，人们加大了对薯蓣资源的开发力度，刺激了对野生盾叶薯蓣的高速无节制利用，很多地方的掠夺式采挖，使野生资源逐渐枯竭；而如果采用人工种植的方式，一方面在盾叶薯蓣种植过程中的循环种-挖，对其产区(主要是山区)脆弱的生态环境会造成严重的破坏，尤其是造成地表植被破坏而引起水土流失，另一方面长期人工种植造成薯蓣种质资源退化，其皂素含量不断降低。同时直接从薯蓣中提取皂甙元的生产工艺会产生大量废水，每生产1吨皂甙元平均排放废水450吨，这些废水有机污染物浓度高、酸度高、色度高，处理难度极大。按照国家污染控制的有关要求，这些高污染企业必须进行废水治理，达到国家一级排放标准，否则自行关闭。特别是在湖北、陕西、河南等省盾叶薯蓣主产区，位于我国重点保护的水资源——南水北调中线水源汉江上游地区，更加重了对皂素行业水污染控制的分量和紧迫性，对水资源的威胁不容忽视。 

植物内生细菌是指能在健康植物组织内栖居而对植物不造成实质性危害而与植物建立了和谐联合关系的微生物。植物内生菌的研究起始于19世纪中叶，1993年Stierle首次报道了从短叶紫杉(Taxus brevifolia)的树皮中分离出一株内生真菌能产生紫杉醇，掀起了从植物内生菌中寻找新物质的热潮。植物体内广泛分布着内生细菌，其长期生活在植物体内的特殊环境中并与宿主协同进化，一方面植物体为其提供生长必需的能量和营养；另一方面，内生菌又可通过自身的代谢产物或借助于信号传导作用对植物体产生影响。内生菌对宿主植物的生物学作用的物质基础，在于其自身合成的抗生素、激素酶抑制剂、诱导物等多 种活性物质或通过诱导物(葡聚糖、糖蛋白、小肽、脱乙酰几丁质、花生四烯酸等不饱和脂肪酸)胁迫宿主植物合成的萜类、生物碱、皂苷、黄酮、酚类和多炔类等次生代谢产物。因此，利用植物内生菌发酵生产与植物相同或相似的次生代谢活性产物是可能的，从特殊环境下的植物和传统的药用植物分离得内生菌，再从内生菌次生代谢产物中筛选具有药用价值的活性物质或新型化合物以创制新药，解决自然资源不足，开发紧缺及新型药物，将在很大程度上丰富人类的药物宝库，同时也有助于保护稀缺的植物资源以及避免脆弱的环境受到破坏。 

发明内容

鉴于以上技术背景中所提出的盾叶薯蓣皂甙元生产中面临的一些问题以及植物内生菌的知识，本发明的目的在于从盾叶薯蓣植株中分离得到能发酵生产盾叶薯蓣皂甙元的内生菌。 

为实现以上目的，本发明的菌种通过以下步骤得到： 

a.从野外采集盾叶薯蓣植株； 

b.选取健壮盾叶薯蓣的地下茎进行表面灭菌； 

c.将表面灭菌后的薯蓣地下茎进行内生菌分离； 

d.将分离得到的内生菌进行液体培养； 

e.对发酵产物提取结晶并检测，确认其为盾叶薯蓣皂甙元。 

步骤b所述表面灭菌方法为：用无菌水将薯蓣地下茎冲洗干净，放入超净工作台，剪成5cm×5cm小块，先在75％的酒精中浸泡30s，然后用0.1％HgCl2溶液浸泡3-5min，接着用无菌水冲洗3次。 

步骤c所述内生菌分离方法为：将薯蓣地下茎切成0.5cm左右的小薄片，接种于PDA平板培养基上。每个培养皿接种1-2片，做4个重复。置于28℃的恒温培养箱中培养3-5d。然后根据细菌的菌落形状、大小，颜色和分布状况等，用接种环从培养基菌落上挑菌少许到新的BPA培养基上，用划线分离法纯化2-3次，直到分离出纯菌种。 

步骤d所述液体培养的方法为：将分离得到的菌种接入BPA液体培养基进行液体培养，置于28℃的恒温摇床上培养，振荡频率为120r/min，培养一周。