[发明专利]一种环境水体样品中多种肠道病原菌的同时定量检测方法

权利要求书

1.一种环境水体样品中多种肠道病原细菌同时快速定量检测方法，其特征在于，该方法运用肠道病原细菌PCR通用引物，建立实时荧光定量聚合酶链式反应体系，定量测定环境水体中大肠杆菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌的细菌细胞密度，具体包括下列步骤：

步骤一，设计并合成肠道病原细菌PCR通用引物：

该肠道病原细菌PCR通用引物的分为上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别为：

上游引物：5’-aaggcgacgatccctagctggtctgagaggatga/c-3’，

下游引物：5’-gcttgccagtatcagatgcagttcccaggttgagc-3’；

步骤二，制作定量PCR标准曲线：

标准曲线的纵坐标是已知细胞浓度的埃希氏大肠杆菌梯度稀释DNA提取物QPCR检测的C_T值，横坐标是相应的埃希氏大肠杆菌细胞密度；

步骤三，细菌浓缩回收及细菌DNA提取：

地表水水样通过离心收集细菌细胞，细菌DNA的提取采用细菌裂解缓冲液及苯酚-氯仿法提取；

步骤四，定量PCR反应体系及相关参数的确定：

QPCR扩增反应体系总体积25μL，内含1×realMastrMix/1×SYBRsolution，dNTP 0.2mmol/L，Taq DNA聚合酶1.0U，1×PCR缓冲液，2.0mmol/LMgCl₂，上下游引物分别为0.1mmol/L，DNA模板2μＬ；

PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃链延伸5min；阴性对照中，用灭菌双蒸水代替DNA模板，每隔0.2s自动读数一次，阈值设定为最初的3～7个循环荧光值标准偏差的10倍；

步骤五，结果计算： 

通过已知细胞数量的埃希氏大肠杆菌QPCR标准曲线，即可确定环境水样中目标细菌细胞的数量。