[发明专利]一种由雷公藤细胞培养法生产雷公藤甲素和生物碱的方法

说明书

技术领域

本发明涉及雷公藤甲素和生物碱生产方法，特别是一种由雷公藤细胞培养法生产雷公藤甲素和生物碱的方法，该方法生产的雷公藤悬浮培养细胞和培养液中所含的雷公藤甲素和总生物碱相对较高，具有生产周期短、效率高、对环境无污染等特点，并且有利于雷公藤自然资源的保护。

背景技术

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)系卫矛科雷公藤属植物，在我国很早以前就用于医学和防治各种害虫，为著名的杀虫植物之一。民间多用于防治蔬菜害虫，故有“菜药”之称。其对多种害虫有效。传统中医上可用于治疗肿胀、水肿、黄白疽、痢疾等，具有明显的抗肿瘤、抗风湿作用。雷公藤属多年生木质藤本、生长缓慢、处于野生状态，因用根入药，大量应用使资源遭到破坏。

雷公藤根中活性成分含量显著高于其他部位，是主要用药部位。现已从中分离出70多种化学成分，其中雷公藤甲素又称雷公藤内酯醇，是中药雷公藤的主要有效成分之一，作为免疫抑制药物，可应用于许多自身免疫性疾病的治疗，同时它又是一种毒性成分。雷公藤生物碱具有明显的体液和细胞免疫抑制作用，也是治疗类风湿性关节炎的有效成分。在农业害虫防治中，雷公藤甲素有较好的触杀活性，雷公藤总生物碱有较好的胃毒毒杀活性和拒食活性。这些有效成分均为次生代谢产物，在雷公藤植株内含量很低，在其他植物内的含量更低，虽然可通过化学分离提取获得产品，但受气候、土壤、分布等因素及有效成分含量、原料、季节等条件的限制，生产受到一定的限制，加上人类对自然的过度开发，资源受到破坏，提取量很有限。利用微生物或化学方法至今不能合成。通过植物细胞培养生产有用的植物次生代谢物是解决植物资源问题的途径之一。

雷公藤细胞培养生产有效成分在国内外也进行了大量研究。在国内，尹作鸿等人从雷公藤的茎、叶诱导出愈伤组织，并进行了组织培养，从中分离得到雷公藤甲素、雷公藤乙素等二萜内酯化合物。这些对雷公藤细胞培养的研究从不同方面进行了有益的探索，但远未达到工业化生产的水平。关于雷公藤悬浮细胞二步培养法生产雷公藤甲素和总生物碱的方法尚未见到报道。

植物细胞全能性的设想于1902年提出，1948年得到了证实，这为进行植物组织培养工作奠定了理论基础，自从1956年Routine和Nickel首次申请用植物组织培养生产有用次生代谢产物的专利以来，应用细胞培养生产有用的次生物质的研究取得了很大的进展。大量研究成果证明，通过植物细胞发酵培养产生有用的次生代谢产物越来越显示出巨大的应用潜力。利用植物细胞培养生产次生代谢产物不受地理、季节变换和各种环境因素的影响；可节省土地，降低成本，缩短生产周期；可以提供一种标准化的生产过程，该过程可以连续生产，产品的质量和产量稳定，便于实行工业化生产，已是解决各种有效成分含量低的植物资源利用的主要途径。这是本申请的试验基础和理论基础。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种由雷公藤细胞培养法生产雷公藤甲素和生物碱的方法。

为了实现上述任务，本发明采取如下技术解决方案得以实现：

一种由雷公藤悬浮细胞通过二步培养法生产雷公藤甲素和生物碱的方法，其特征在于，具体包括下列步骤：

步骤一，以雷公藤一年生枝条扦插形成的不定根为外植体；用洗洁精洗涤并用自来水反复清洗后，流水冲洗2小时，用含70％质量分数的酒精消毒20s，然后以无菌水冲洗4次，再用1g/L HgCl₂消毒4min，无菌水冲洗4次；

步骤二，将不定根的幼根切成小段；接种在培养基上，放置在培养室进行愈伤组织诱导，培养基组成为：MS+(0.5～1.0)mg/L 2，4-D+(0.1～0.5)mg/L KT，pH值为5.8，并在培养基中加入蔗糖30g/L，培养室温度为25±1℃，保持每天12小时的光照，光照强度为1000lx～1500lx，20天～30天后形成愈伤组织；

步骤三，将形成的愈伤组织置入培养基中继代培养，40～45天继代一次，连续继代5代，培养基组成为：6，7-V+(0.5～1.0)mg/L 2，4-D+(0.1～0.5)mg/L KT；

步骤四，挑选生长快、有光泽、质地疏松，颗粒状愈伤组织，接种量为8g/L～12g/L，接种在培养基上建立雷公藤悬浮细胞系，培养基的组成为NT+(0.5～1.0)mg/L 2，4-D+(0.1～0.5)mg/L KT，选择250mL三角瓶，装培养基100mL，放入培养室中的摇床上震荡培养，培养条件为：温度25±1℃，自然光照，摇床转速120转/分钟，每25～30天继代培养一次，连续继代培养5次以上，即获得雷公藤悬浮细胞系，作为供试种子；