[发明专利]人源化异种细胞外基质材料及其制备方法

权利要求书

1.一种人源化异种细胞外基质材料，其特征在于，是在异种细胞外基 质上复合有人体细胞合成分泌的细胞外基质和细胞生长因子所构成的干燥 多孔泡沫状材料；所述的异种细胞外基质是哺乳动物组织经脱细胞处理后 所形成的生物医用材料；所述的人体细胞为成体细胞或是成体干细胞。

2.制备权利要求1所述人源化异种细胞外基质材料的方法，包括有细 胞获取的步骤，其特征在于，具体步骤如下：

1)、细胞的获取：根据所修复组织受区的需求选择细胞的类型，按常规 的细胞培养方法进行体外培养和大规模扩增；

2)、异种细胞外基质的制备：将获取的动物皮肤、或筋膜、或小肠粘膜 下层、或羊膜、或肌肉、或肌腱、或血管、或神经的任一种生物材料切成小 块，置于含有过氧乙酸和乙醇的水溶液中浸泡消毒不低于1小时；用磷酸盐 缓冲液漂洗；置于NaOH溶液浸泡处理后，用磷酸盐缓冲液浸洗至pH中性， 再置于含有DNA酶和α-半乳糖苷酶的混合溶液中浸泡25分钟以上，用磷酸 盐缓冲液漂洗；经脱水干燥后使用牛血清或胶原蛋白或多聚赖氨酸或精氨酸- 甘氨酸-天冬氨酸的任一种溶液浸泡20分钟以上；再经干燥后形成异种细胞 外基质，灭菌消毒；所述DNA酶的终浓度为30～50U/ml，α-半乳糖苷酶的终 浓度为10～25U/ml；

3)、专用培养液的配制，其组分按体积百分比包括有：商用最低必需培 养液DMEM 67.5％、商用培养液F12为22.5％、胎牛血清5～15％，胰岛素1～ 50μg/ml、碱性成纤维细胞生长因子1～10ng/ml、氢化可的松10～500 ng/ml、腺嘌呤0.2～0.25mM、转铁蛋白1～10μg/ml、维生素C 10～50μg/ml；

4)、人源化异种细胞外基质材料的制备：将体外扩增培养的细胞用细胞 培养液悬浮，按10⁴～10⁶个/cm²的密度滴加在异种细胞外基质表面，在5 ％CO₂环境中37℃条件下静置贴附后，置入专用培养液中培养2～3天；弃 去培养液，将异种细胞外基质未种植细胞的一面向上，再按照上述方法以 10⁴～10⁶个/cm²的密度种植细胞，静置后加入专用培养液培养2～3天；再 将两面复合有细胞的异种细胞外基质置于培养器皿内的培养支架上，用专 用培养液继续培养6～10天，每2天换液，培养完成；上述的培养条件均 为37℃的5％CO₂环境；

5)、干燥：将完成培养后的材料浸泡于冷冻保护液中25分钟以上，经冷 冻干燥、灭菌消毒后，得到复合有人体细胞合成分泌的细胞外基质和细胞生 长因子的人源化异种细胞外基质干燥多孔泡沫状材料；所述的冷冻保护液为 Hanks平衡盐溶液中按重量比加有0.1～10％葡萄糖、0.1～5％蔗糖、0.1～5％ 海藻糖、0.1～0.5％人血清白蛋白。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中所述过 氧乙酸的终浓度体积比为0.1～0.5％，乙醇的终浓度体积比为2～10％。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中所述的浸泡 消毒清洗后，NaOH溶液浸泡前，将材料置于-80℃冷冻半小时以上，取出后自 然解冻，如此反复冻融2～5次，用磷酸盐缓冲液清洗后再于NaOH溶液浸泡。