[发明专利]人源性亚硝基化的硫氧还蛋白在制备治疗缺血性心脏病药物的应用

说明书

技术领域

本发明涉及应用重组蛋白质技术及蛋白翻译后修饰技术治疗心血管疾病领域，更具体地说，涉及人一种已知的源性亚硝基化的硫氧还蛋白(S-nitrosylatedhumanThioredoxin，s-hTrx)作为治疗缺血性心脏病药物的应用。

背景技术

缺血性心脏病是当今世界威胁人类健康的首敌。随着冠状动脉内溶栓及冠脉搭桥等内外科治疗手段的广泛应用，继之出现的心肌细胞再灌注损伤日益受到心脏病学家的高度重视。来自动物实验和临床观察的证据表明，心肌细胞凋亡和心肌坏死是心肌局部缺血/再灌注(MI/R)损伤后心肌梗塞的主要原因。由于心肌坏死的不可逆性，应用各种药物和基因治疗手段抑制和预防心肌凋亡已引起众多学者的关注。

Trx是分子量大约为12kDa的小分子蛋白质，它的氨基酸序列中含有调节氧化还原活性的二硫键/巯基，该结构位于保守序列：胱氨酸-甘氨酸-脯氨酸-胱氨酸中，为其活性中心。氧化型Trx)Trx-S2)含有二硫键，还原型Trx)Trx-)SH)2)含有巯基。Trx就是通过二硫键和巯基的互换来实现其氧化还原调节功能的。其在细胞内广泛表达，控制细胞还原/氧化)redox)状态和细胞增殖/生存。近期的研究结果表明，Trx在多种心血管疾病的发生与发展中扮演重要角色。Trx能阻止斑块中过氧亚硝酸盐造成的内皮细胞损伤；血浆中的Trx水平与心肌炎、急性冠脉综合征、扩张型心肌病和心衰的严重性之间呈负相关。重组人Trx对再灌注诱发的心律失常有保护作用，减轻内皮细胞、大脑和肾脏的缺血再灌注损伤。目前的研究证据还表明，Trx可以发生多种蛋白翻译后修饰从而改变其自身的活性。这些结果提示，Trx可能具有直接的心脏保护作用。亚硝基化是在蛋白质半胱氨酸巯基上加上NO°基团从而改变蛋白质功能的一种蛋白质翻译后修饰。亚硝基化，硝基化与磷酸化是目前已经发现的影响蛋白质功能的主要蛋白翻译后修饰形式。亚硝基化已经被证实可以改变多种凋亡信号转导蛋白的活性。重组人Trx具有5个半胱氨酸残基，其69位半胱氨酸被证实是发生亚硝基化修饰的主要部位，并可以增强其心脏保护作用。心肌梗死患者在进行血运重建时产生缺血/再灌注损伤，给予这类患者补充外源性s-hTrx可能成为一种心肌保护的治疗手段。

虽然目前临床上可以通过溶栓或介入的方法恢复心肌梗死患者缺血心肌的血供，但尚未有针对减轻缺血/再灌注损伤的药物应用于临床，因此，急需开发一类效果可靠、副反应较少、应用简单的药物填补这一领域的空白。

发明内容

本发明的目的在于，提供s-hTrx用于制备治疗缺血性心脏病药物的应用，特别是在发生心肌梗死后接受血管再通治疗时，通过外源性给药，以减轻缺血心肌损伤。

申请人研究表明，s-hTrx有很强的生物学活性，给药后反应迅速，生物利用度好，有着很好的临床应用前景。

申请人在研究中发现：

(1)在体给予外源性Trx，能够进入缺血心肌，减少缺血再灌注导致的细胞凋亡和心梗范围，从而发挥显著的心脏保护作用；

(2)发生于TrxCys-69的巯基亚硝基化，显著加强天然Trx的心脏保护作用；

(3)Trx发挥其保护作用，至少部分是通过抑制p38-MAPK凋亡信号转导通路激活，Trx亚硝基化可以增强这一作用；

(4)外源性给予的s-hTrx，可以作为S—NO的来源，补充缺血再灌注导致的心肌中巯基亚硝基化蛋白质的减少。

附图说明

图1显示了给予SwissWebster小鼠外源性Trx腹腔注射，能够进入缺血/再灌注心肌，采用免疫组织化学法检测心肌细胞中外源性人硫氧还蛋白(hTrx)的分布。在安慰剂治疗的小鼠心肌组织中没有免疫染色反应(1A)。相反，在hTrx治疗的小鼠心肌中出现明显的强阳性染色(1B)。在非缺血区虽然也有外源性Trx的存在(1C)，但Trx含量明显少于缺血区(1D)。

图2-4是给予SwissWebster小鼠外源性Trx腹腔注射，可以减少缺血/再灌注诱导的心肌细胞凋亡。图2DNA电泳典型结果：M表示DNAmarkers，sham为对照组(lane2)，MI/R为缺血再灌注组)lane3，4)，Trx为Trx治疗组)lane5，6)。