[发明专利]水体中的粪肠球菌的酶联免疫检测溶液及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及环境科学水处理领域，具体地说，涉及水体中的粪肠球菌的快速检测方法。

背景技术

粪肠球菌为圆形或椭圆形、呈链状排列的革兰氏阳性细菌，无芽孢、无鞭毛，为需氧或兼性厌氧菌。肠球菌主要存在人类或动物的肠道，是人体肠道的正常菌群，在人类粪便中的数量仅次于大肠菌群，其致病力较弱。生活污水、处理后废水及各种用于娱乐水体中均可检出常见菌株粪肠球菌。但目前对实际环境中粪肠球菌的定性、定量检测研究较少，国外仅见利用PCR技术检测粪肠球菌及利用酶联免疫技术测定粪肠球菌表面蛋白Esp和荚膜多糖的报道，因此建立快速检测粪肠球菌的方法对完善淡水、海水水质检测标准具有重要的意义和实际应用价值。

目前对实际环境中粪肠球菌的定性、定量检测研究较少，究其原因，可能存在一下几个方面的问题：

1.日常水质检测指标大肠菌群不包含粪肠球菌，因而一直以来未得到足够的重视。

2.该菌对营养要求较高，培养较困难。

3.目前对粪肠球菌的研究多为临床分离菌株的耐药机制、不同菌株的耐药类型、致病基因、膜蛋白及胞外酶等，对粪肠球菌的定量检测研究较少。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够快速检测水体中的粪肠球菌的酶联免疫检测溶液和检测方法。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一组快速检测粪肠球菌的溶液，包括

pH7.4的PBS缓冲液：KCl：KH₂PO₄：Na₂HPO₄—12 H₂O：NaCl重量比为1：1.2：14.5：40；用于ELISA过程中所有样品的稀释和洗板。

包被液：Na₂CO₃：NaHCO₃重量比为1：1.9～2.0；用于稀释抗原，使抗原与酶标板结合力更高。

PBST洗涤液：1000ml PBS缓冲液加Tween-20 0.5ml；用于洗板的溶液，Tween-20为表面活性剂，使清洗更加彻底。

稀释液：PBS加1％牛血清白蛋白(BSA)；用于抗血清和二抗的稀释，BSA可以使一抗、二抗更加稳定，减少非特异性反应。

封闭液：PBS加2％BSA；包被之后，用于堵塞酶标板上没有结合抗原的部分，减少后续加入的各种蛋白质对酶标板的吸附，防止非特异性反应的发生。

二抗：羊抗兔IgG—HRP酶标抗体；与抗血清结合，故称为二抗或者抗抗体，HRP为辣根过氧化物酶，是迄今在ELISA中使用最广泛的标记酶，其性质稳定，与抗原或抗体耦联后，活性很少受损失。

底物溶液：四甲基联苯胺(TMB)可溶性单组分底物溶液；TMB为HRP色原底物，与HRP反应后在波长450nm处有最大吸光度，其具有灵敏度高，无毒性等优点。

终止液：2M的H₂SO₄；可使TMB与HRP反应的产物稳定存在。

一种快速检测粪肠球菌的方法，包括以下步骤：

A、抗血清获得：粪肠球菌置于0.05％甲醛溶液中，30℃下灭活8h；灭活菌体用生理盐水反复洗涤，重复离心三次，制成终浓度为1×10¹⁰CFU/mL的抗原；雄性新西兰大白兔2只，耳缘静脉注射灭活抗原，第一次1mL/只，此后每次增加0.1mL；第二次免疫距第一次2周，此后每周一次，共6次；末次注射后一周，耳动脉采血，玻片凝集法测定效价，达到1280：1以上即从心脏取血；取血后将血清置于室温凝固1h，后4℃静置过夜，4℃3000r/min离心15min，分离上清液，得到抗血清；

B、抗血清与屎肠球菌(Enterococcus faecium)、盲肠肠球菌(Enterococcus cecoum)、坚强肠球菌(Enterococcus durans)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)反应，4℃3000r/min离心去除发生交叉反应部分；