[发明专利]铜绿假单胞菌泳动能力相关基因PA5001及应用

说明书

【技术领域】：本发明属于微生物生物技术领域，特别涉及一种铜绿假单胞菌泳动能力相关基因PA5001。

【背景技术】：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)，属于假单胞菌属(Pseudomonas)，又称为绿脓杆菌，革兰氏阴性菌，是一种在自然界(如土壤、水和空气)中广泛的条件致病菌。在临床上常引起难治性反复性感染，其中生物被膜的形成是一个重要的因素，细菌在被膜的屏障保护作用下具有很强的抗药性及抗吞噬、抗趋化作用。据报道，60％以上微生物感染是由细菌生物被膜造成的。

鞭毛作为主要运动器官和重要的毒力因子，对铜绿假单胞菌获得营养物质，逃避有害物质，转移到合适的寄主，找到合适的固着位点和向环境扩散传播起着重要作用。泳动是细菌在单端鞭毛的推动下，单个菌体细胞在水分含量高的环境中的运动方式，是一种个体的行为。鞭毛介导的泳动在生物被膜形成的早期和形成正常的生物被膜结构中起着关键的作用。

目前已知至少有35个基因与鞭毛的合成和功能相关，新的鞭毛相关基因不断的被发现。对鞭毛运动能力相关基因的研究可以为揭示鞭毛运动机理、研究新基因的功能，探索铜绿假单胞菌的致病机制，为药物设计提供新的靶位点，为预防和抑制铜绿假单胞菌的感染提供理论依据。

【发明内容】：本发明目的是发现与鞭毛运动能力相关的新基因，以此为靶位点，设计新的抗菌药物，预防和治疗铜绿假单胞菌引起的感染。

本发明提供的铜绿假单胞菌泳动能力相关基因PA5001，具有如序列表序列1所示核苷酸序列。

上述的铜绿假单胞菌泳动能力相关基因PA5001的应用，用于以该基因为新药靶点设计并制备抑制菌体泳动能力的药物，以降低其毒力及致病性，增强抗生素的药效。

本发明的基因PA5001获得方法是：利用Mu转座重组技术，构建转座子插入突变文库，筛选鞭毛泳动能力丧失的突变子，提取基因组DNA，用Bam HI酶切基因组DNA，酶切片段与pUC18载体连接，通过电转化将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在含氨苄青霉素和卡那霉素双抗的LB平板上，经过PCR和酶切鉴定，筛选阳性转化子，测序确定转化子中Mu所插入片段的核苷酸序列，经NCBI Blast比对确定Mu所插入的基因位置。

本发明的有益效果：

PA5001基因Mu插入失活的突变株丧失泳动能力，说明此基因与铜绿假单胞菌鞭毛的运动有关，而该基因是一个功能完全未知的新基因，本实验首次发现其与鞭毛运动能力相关。新基因功能的发现对揭示鞭毛运动机制、提供药物设计的靶位点，预防和治疗铜绿假单胞菌的感染都有指导意义

【附图说明】：

图1、铜绿假单胞菌泳动能力的检测

1.野生型PA68作为阳性对照　2、PA5001::Mu突变株

图2转化子PCR产物的电泳检测，1.DL2000　2.Mu克隆子PCR产物

以Mu1和Mu2为引物，以克隆子菌液为模板，理论上可以扩增出700bp左右的特异性片段，表明克隆子质粒中携带着Mu转座子DNA片段。

图3.克隆子酶切产物电泳图

1、DL15000 2、质粒 3、质粒酶切

【具体实施方式】：

实施例1：使用Mu转座重组技术进行突变文库的建立

1.从于37℃培养16～20h的新鲜平板上挑取一个PA68单菌落，转到含有5mL LB液体培养基的试管中，37℃，200rpm，过夜振荡培养14～18h。

2.次日按1∶100转接到含有100mL LB液体培养基的三角瓶中，37℃，200rpm，振荡培养约3-5h，使用752分光光度计测定细菌培养物在540nm处的吸光度，在OD₅₄₀＝0.5～0.6时，停止培养。

3.在无菌条件下将菌体转移到一个无菌的预冷的50mL离心管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。

4.于4℃，6000rpm，离心10min，收集菌体。

5.倒出培养液，用100mL预冷的300mM蔗糖重悬菌体，4℃，6000rpm，离心10min。

6.重复(5)，依次用50mL、20mL预冷的300mM蔗糖溶液重悬、洗涤菌体。

7.最后将细胞溶于1mL300mM蔗糖溶液中，分装成100μL/管，制备好感受态细胞悬液，冰浴保存备用。