[发明专利]铜绿假单胞菌鞭毛运动能力相关基因PA5017及应用

说明书

【技术领域】：本发明属于微生物生物技术领域，特别涉及一种铜绿假单胞菌鞭毛运动能力相关基因PA5017。

【背景技术】：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)，属于假单胞菌属(Pseudomonas)，又称为绿脓杆菌。革兰氏阴性菌，广泛分布于自然界中(如土壤、水和空气)，正常人体的皮肤、肠道和上呼吸道中，是一种重要的条件致病菌。在一些慢性疾病、某些导致宿主免疫功能受损的因素，易引起支气管-肺部的原发性铜绿假单胞菌感染。同时也是严重烧伤、创伤感染病人，囊性纤维变病人及晚期肿瘤患者死亡的重要原因，常引起菌血症、肺炎、泌尿系统感染、烧伤感染和支气管扩张、慢性支气管炎及囊性纤维化继发感染等疾病，严重危害着人类的健康和生命。

铜绿假单胞菌的鞭毛是一种重要的毒力因子，同时其介导的泳动及蜂群运动也是菌株毒力的重要组成部分，鞭毛缺陷的菌株毒力明显减弱。泳动是细菌在单端鞭毛的推动下，单个菌体细胞在水分含量高的环境中的运动方式，是一种个体的行为。蜂群运动则是细菌在半固体环境中的群体之间互相协调运动方式，需要鞭毛和菌毛及鼠李糖脂表面活性剂的参与。

目前已知至少有35个基因与鞭毛的合成和功能相关，新的鞭毛相关基因不断的被发现。对鞭毛运动能力相关基因的研究可以为揭示鞭毛运动机理、研究新基因的功能，探索铜绿假单胞菌的致病机制，为药物设计提供新的靶位点，为预防和抑制铜绿假单胞菌的感染提供理论依据。

【发明内容】：本发明目的是发现与鞭毛运动能力相关的新基因，以此为靶位点，设计新的抗菌药物，预防和治疗铜绿假单胞菌引起的感染。

本发明提供的铜绿假单胞菌鞭毛运动能力相关基因PA5017，具有如序列表序列1所示核苷酸序列。

上述的铜绿假单胞菌鞭毛运动能力相关基因PA5017可以用于以该基因为新药靶点设计并制备抑制菌体鞭毛运动的药物，以降低其毒力及致病性，增强抗生素的药效。

本发明基因PA5017的获得方法：利用Mu转座重组技术，构建转座子插入突变文库，泳动或蜂群运动丧失的突变子，提取基因组DNA，用Bam HI酶切基因组DNA，酶切片段与pUC18载体连接，通过电转化将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在含氨苄青霉素和卡那霉素双抗的LB平板上，经过PCR和酶切鉴定，筛选阳性转化子，测序确定转化子中Mu所插入片段的核苷酸序列，经NCBI中Blast比对确定Mu所插入的基因位置。

本发明的有益效果：

PA5017基因Mu插入失活的突变株丧失泳动和蜂群运动能力，说明此基因与铜绿假单胞菌鞭毛的运动有关，而该基因是一个功能完全未知的新基因，本实验首次发现其于鞭毛运动能力相关。新基因功能的发现对揭示鞭毛运动机制、提供药物设计的靶位点，预防和治疗铜绿假单胞菌的感染都有指导意义。

【附图说明】：

图1A.泳动能力检测；B.蜂群运动能力检测。

1、野生型PA68作为阳性对照　　　2、PA5017::Mu突变株

图2Mu克隆子酶切产物电泳图

1、DL15000  2、克隆子质粒酶切  3、克隆子质粒

图3.Mu转座子PCR产物电泳图(用PCR方法检测转化子的Mu转座子)

1、DL2000   2、Mu克隆子PCR产物

【具体实施方式】：

实施例1：使用Mu转座重组技术进行突变文库的建立

1.从于37℃培养16～20h的新鲜平板上挑取一个PA68单菌落，转到含有5mL LB液体培养基的试管中，37℃，200rpm，过夜振荡培养14～18h。

2.次日按1∶100转接到含有100mL LB液体培养基的三角瓶中，37℃，200rpm，振荡培养约3-5h，使用752分光光度计测定细菌培养物在540nm处的吸光度，在OD₅₄₀＝0.5～0.6时，停止培养。

3.在无菌条件下将菌体转移到一个无菌的预冷的50mL离心管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。

4.于4℃，6000rpm，离心10min，收集菌体。

5.倒出培养液，用100mL预冷的300mM蔗糖重悬菌体，4℃，6000rpm，离心10min。

6.重复(5)，依次用50mL、20mL预冷的300mM蔗糖溶液重悬、洗涤菌体。

7.最后将细胞溶于1mL300mM蔗糖溶液中，分装成100μL/管，制备好感受态细胞悬液，冰浴保存备用。