[发明专利]一种体外制备抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外制备抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法。

背景技术

转移因子是从淋巴细胞中提取的一种低分子多肽与核酸复合物，能特异性或非特异性地提高机体免疫功能，传递免疫信息，被誉为细胞免疫激活剂。它无种属特异性，可在种属间传递，动物来源可用于人类。

转移因子常规的制备方法是：将动物新鲜或冷冻的脾脏及淋巴结在25℃左右去除脂肪及结缔组织，然后用纯化水洗净；将洗净的组织切成小块，加入适量水，用组织捣碎机破碎细胞，制成匀浆，加适量纯化水，混匀，置-20℃反复冻融5～8次，融化温度不得超过37℃；将冻融的匀浆离心(离心温度4℃)，去沉淀，留上清液备用；上清液装透析袋，透析24-48小时，半成品过滤除菌；成品的配置与检验。

转移因子是经诱导，由动物免疫防御系统产生的可对抗外源性病原体的防御性肽类活性物质，分子量小、活性强，具有抗细菌、真菌、病毒和原虫作用，甚至对癌细胞也具有杀伤作用，应用十分广泛。转移因子作为具有特异性与非特异性的免疫活性细胞调节因子，广泛应用于治疗任何动物病毒性疾病、真菌感染、细胞免疫减弱或缺陷病以及恶性肿瘤的辅助治疗，并有好的疗效。但制备转移因子的工艺繁琐复杂、回收率低、无特异性。本发明通过体外制备抗鸡新城疫病毒特异性转移因子特异性强、产出率高。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中制备的及转移因子针对疾病没有特异性，治疗效果不稳定等缺点，提供一种体外免疫法生产特异性强、成本低、产出率高、效果更好的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法。

本发明的技术解决方案概述如下：

一种体外制备抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法，由如下步骤组成：

(1)无菌采取实验鸡脾脏或抗凝血，用脾脏或外周血制备淋巴细胞单层；

(2)对淋巴细胞单层进行传代培养；

(3)当淋巴传代细胞长成单层后，用植物血凝素和鸡新城疫病毒诱导培养，即获得体外制备抗鸡新城疫病毒特异性转移因子。

刺激鸡脾细胞和鸡血淋巴细胞增殖的植物血凝素剂的质量浓度为20-200mg/L。

本发明的优点：

本发明以较少的鸡脾脏或外周血为原料，制成淋巴细胞单层，在体外培养，然后用植物血凝素和鸡新城疫病毒诱导培养诱导淋巴细胞单层即可体外生产出大量抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的混合体，本发明的方法制备的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子无需进一步的提纯，直接将混合体用于禽类，即可起到抗鸡新城疫病毒及抗菌的作用，同时提高禽类的免疫力。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种体外制备抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法，步骤：

(1)无菌采取实验鸡脾脏，用脾脏制备淋巴细胞单层，步骤为：

A、处理鸡脾脏

取新鲜鸡脾脏置于无菌玻璃容器中，加入PBS(pH为7.2)溶液浸泡半小时或浸于质量百分浓度为1％的新洁尔灭溶液中，取出以酒精消毒脾脏表面，用解剖剪及镊子去除脾脏脂肪及包膜，用PBS(pH为7.2)液洗涤一次，再将脾脏剪成小段移入平皿中，最后用眼科剪将脾脏剪成1mm3小块，再用PBS(pH为7.2)液洗涤2-3次，以去除血细胞、色素物质及剪碎过程中机械损伤的细胞；

B、消化及分散组织块

将上步清洗过的PBS(pH7.2)液吸掉、将剪碎的组织块移入锥形瓶中，按组织块体积的5倍量加入0.25％胰蛋自酶液(pH为7.6～7.8)，置37℃水浴中消化20～40分钟。每隔10分钟摇动一次锥形瓶，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、表面发毛时为止，这时从水浴中取出锥形瓶，吸去胰蛋白酶液，再用PBS(pH为7.2)液洗涤2～3次，用0.5％水解乳蛋白-Hanks液洗，用口径稍大的细管吹打数次，用四层纱布滤过；

C、细胞计数

采用血球计数板进行计数，计数方法与白细胞计数相同；

D、细胞悬液的分装和培养

按细胞计数结果，将细胞悬液用DMEM营养液调整至60万/毫升细胞悬液。将细胞悬液分装入细胞培养瓶(100ml)和细胞转瓶，分装量为该瓶容量的1/5，盖上盖，做好标识，然后将细胞培养瓶和转瓶分别放在二氧化碳培养箱和转瓶机上培养；

E、观察

置于37℃培养的细胞，需逐日进行观察。若细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段直至形成淋巴细胞单层。

(3)对淋巴细胞单层进行传代培养