[发明专利]组氨酸标签蛋白功能化的碳纳米管的制备方法及应用

权利要求书

1.组氨酸标签蛋白功能化的碳纳米管的制备方法，其特征是该方法包括如下步骤：

(a)在敞开反应容器内，加入0.2～2g碳纳米管MWCNT，以及浓硫酸与浓硝酸按体积 比为1∶1～3∶1的混合酸，碳纳米管与混合酸的质量体积比m/V为1∶20，常温超声分散60 ～120min，制得均匀分散的MWCNT黑色悬浊液；

(b)取15～25mL(a)步制得的MWCNT黑色悬浊液于烧杯中，加热到65℃至75℃，5～15 h；

(c)向(b)步加热后的黑色悬浊液中加入蒸馏水稀释，7000rpm离心5min，弃去上清酸液；

(d)再向(c)步弃去上清酸液后的最终产物中加入蒸馏水，通过0.22μm的聚碳酸酯膜过 滤，再用蒸馏水反复洗涤过滤物至过滤液的pH＝6～7；真空干燥，得到碳纳米管甲酸 MWCNT-COOH；

(e)由pMDGLP-D质粒连接pET-22b(+)载体表达产生重组pET-22b八拷贝表达载体；再将 重组pET-22b八拷贝载体转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株产生大肠杆菌BL21(DE3)/G8菌 株；将大肠杆菌BL21(DE3)/G8菌株接种于50mL LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜， 加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2～0.6mM，诱导表达；菌液在4℃下，8000～12,000rpm 离心5min，细胞悬液用超声波破碎处理，收集可溶性蛋白；再用6聚组氨酸标签亲和层 析柱分离纯化，得到组氨酸标签蛋白质；

(f)制备组氨酸标签蛋白功能化的碳纳米管，100mL的三口瓶中加入(d)步中的回收产 品MWCNT-COOH，将MWCNT-COOH分别用NHS和EDAC活化并反应成内酯基团， 悬浊液通过PTFE膜过滤分离，并用乙醇和蒸馏水洗涤；

(g)将(f)步中的活性内酯化的碳纳米管与(e)步得到的组氨酸标签蛋白反应，分散于PBS 溶液中，混合在2-吗啉乙磺酸MES缓冲溶液中，pH＝6.4；混合溶液避光搅拌2～10h.， 即制得组氨酸标签蛋白功能化的碳纳米管。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于(a)步所述的混合酸是体积比为3∶1的 浓H₂SO₄与浓HNO₃。

3.权利要求1所述的方法制备的组氨酸标签蛋白功能化的碳纳米管的应用，将组氨 酸标签蛋白功能化的碳纳米管作为固相萃取剂，用于过渡金属元素Cu或Ni的选择性吸 附，并应用于含相应元素的样品测定。