[发明专利]用叶表皮细胞死亡率鉴定杨树耐盐潜力的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术的植物检测，是一种叶表皮细胞死亡率鉴定杨树耐盐潜力的方法。

背景技术

随着世界人口的增长和人们生活水平的提高，土地和淡水资源越来越匮乏，土地盐碱化成为日益严重的环境问题之一。开发利用广大的中重度盐碱地，既可以阻止土壤盐渍化的进一步加剧，又能扩大农田的种植面积，解决人口增多与耕地减少的矛盾。杨树在缺林少木的盐碱、干旱、贫瘠和荒漠地区栽植，可迅速恢复植被，减少风沙危害、降低地下水位、保护农田、减少地表蒸发，增加森林覆盖率，也为纸浆用材林建设和工业商品林建设提供足够的原材料。杨树是杨柳科杨属植物落叶乔木的通称。全属有100多种，它可以分为大叶杨、白杨、青杨、黑杨、胡杨等5类。杨树是地球上分布很广的一种树种，欧、亚、北美洲都有它的足迹，中国有50多种。杨树又是用材林、防护林和四旁绿化的主要树种。杨树是通过分子杂交技术和耐盐突变体筛选，获得了不同耐盐性的杨树新品种。但各种基因之间不断地进行重组和分离，如何准确地鉴别和筛选耐盐的优良基因型，成为科学家苦苦探索的关键技术。

杨树的评价主要是在大田条件下对生物学特征、形态特征、抗性、适应性等指标进行评价，现在不但注重杨树资源的生产力、适应能力，而且更加关注资源的分子遗传多样性、木材品质和抗性等遗传能力。杨树的耐盐碱筛选鉴定主要是比较其存活率、相对生长量、鲜干重比和脯氨酸含量等等的生物学鉴定、分子鉴定和直接盐碱地筛选鉴定。但是杨树生长期长，评价生长形状、物候性状、生长期等需要的时间较长，费时费力，分子鉴定成本较高，耗费人力物力，选择一个优良基因型需要较长时间，而且受环境因素的影响。

在高渗环境中，植物细胞由于液泡失水而使原生质层与细胞壁分离的现象，叫做质壁分离。质壁分离是植物生活细胞所具有的一种特性。可以用来区别细胞的死活；也可用来测定细胞液的渗透压，以及原生质的透性、弹性、粘滞性等。造成质壁分离的原因是：细胞壁是全透性的膜，而质膜和液泡膜均是选择透过性的膜，当外界溶液的浓度比细胞液的浓度高时，细胞液的水分就会向外渗出，液泡的体积缩小，由于细胞壁的伸缩性有限，而原生质的伸缩性较大，所以在细胞壁停止收缩后，原生质继续在收缩，这样原生质层与细胞壁就逐渐分开，原生质层与细胞壁之间的空隙里就充满了外界浓度较高的溶液。如果把发生了质壁分离现象的细胞再浸入浓度很低的溶液或清水中，外面的水就进入细胞，液泡变大，整个原生质层又慢慢恢复到原来的状态，这种现象叫做质壁分离的复原。对杨树而言，盐胁迫首先是通过渗透势的改变引起细胞内容物的外流，从理论上讲也会出现质壁分离。在相同的盐胁迫环境中，耐盐基因型的质壁分离情况和不耐盐的基因型应该有明显的区别。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种叶表皮细胞死亡率鉴定杨树耐盐潜力的方法。只需20-30分钟就能准确判断基因型的耐盐潜力，省工省时，工作效率极高。

本发明的技术方案是：

一种用叶表皮细胞死亡率鉴定杨树耐盐潜力的方法，其特征在于：

1)耐盐能力不同的杨树基因型，其叶表皮细胞在盐溶液中的死亡率有很大的差异；在高盐溶液中处理一定的时间，叶表皮细胞的死亡率，能快速准确地反映基因型的耐盐能力；细胞死亡率高的耐盐能力低，细胞死亡率低的耐盐能力高；

2)以对植物无毒的活体染料中性红为指示剂，在微碱性环境中对杨树植株的叶表皮细胞进行染色，活细胞的液泡被染成樱桃红色，原生质和细胞壁一般不着色；死细胞由于原生质变性凝固，胞液不能维持在液泡内，用中性红染色后，不产生液泡着色现象。

选择化学纯的NaCl，溶液浓度一般以4M为宜，处理时间10-15分钟；杨树叶表皮细胞对盐胁迫的灵敏度在基因型间有明显差异：

以对细胞无害的0.03％活体染料中性红为指示剂，对在盐溶液中处理一定时间杨树的叶表皮细胞染色8-10分钟，活细胞呈樱桃红色，统计细胞死亡率，从而判断耐盐能力不同的杨树基因型。

染色时间10分钟；叶表皮厚度应均匀一致。

本发明效果是：