[发明专利]链霉菌单孢子悬液制备方法

说明书

【技术领域】：本发明涉及链霉菌单孢子悬液制备技术领域。

【背景技术】：链霉菌是医用及农用抗生素的重要来源，但是野生菌株产抗生素的能力较低，因此对野生菌株的孢子进行诱变，提高菌株抗生素产量是抗生素工业中的一项重要研究内容。制备链霉菌单孢子悬液是对菌株进行诱变的一项重要基础性工作。

目前国内外通常采用的单孢子悬液制备方法主要是脱脂棉过滤法，此法制备的单孢子悬液中单孢子含量低，往往含有大量的双孢子、三孢子甚至是孢子链，采用这种孢子悬液进行诱变获得假阳性正向突变株的概率较高，所得菌株经传代后常常出现抗生素产量迅速降低至出发菌株产量水平的现象，从而给诱变工作带来极大不便。采用单孢子悬液诱变可减少突变菌株的回复突变，极大提高优良菌株的筛选效率。

【发明内容】：本发明的目的是解决目前制备方法中单孢子含量低的问题，提供一种采用微孔滤膜制备链霉菌单孢子悬液的方法。

本发明提供的链霉菌单孢子悬液的制备方法包括：

第一、保证无菌条件下，于具棉塞试管中制备菌株最适宜的斜面培养基；

第二、将链霉菌孢子在无菌条件下接种于制备好的斜面培养基上，在生化培养箱中常规培养5～14天，待斜面上菌落生长成熟后备用；

第三、将0.45μm滤膜过滤的蒸馏水于高压灭菌锅中121℃灭菌20～30min备用；

第四、向第二步菌落新生长成熟的试管中加入10～15ml第三步灭菌后的蒸馏水，在无菌条件下用接种环轻轻刮下斜面上孢子，将含有孢子的无菌水转入经灭菌后的50ml小三角瓶中，用无菌蒸馏水调整孢子悬液体积至20ml，加入5～10粒直径3～5mm的无菌玻璃珠，在回转式摇床上于150～250r/min条件下打碎1～3h；

第五、用5～10ml无菌注射器吸取第四步中经打碎的孢子悬液；

第六、在第五步所述注射器前部加装直径10～25mm无菌过滤头，内装孔径为1.0～5.0μm的醋酸纤维素或尼龙无菌滤膜；

第七、手动加压使注射器中的孢子悬液通过滤膜并收集于无菌容器内即得单孢子悬液。

第八、取少量制备好的单孢子悬液于显微镜下观察，如单孢子率大于98％则表明制备液合格，如单孢子制备率较低可选用孔径较小滤膜，建议将第五步所述醋酸纤维素或尼龙无菌滤膜的孔径选为孢子直径的1～2倍为宜。

本发明的优点和积极效果：

本发明开发出一种快速、简便、单孢子产率高的链霉菌单孢子悬液制备方法。采用本发明方法制备的链霉菌单孢子悬液中单孢子率在98％以上。

【具体实施方式】：

实施例1、

第一、保证无菌条件下，于具棉塞试管中制备菌株最适宜的斜面培养基；

第二、将链霉菌孢子在无菌条件下接种于制备好的斜面培养基上，在生化培养箱中常规培养14天，待斜面上菌落生长成熟后备用；

第三、将0.45μm滤膜过滤的蒸馏水于高压灭菌锅中121℃灭菌20min备用；

第四、向第二步菌落新生长成熟的试管中加入15ml第三步灭菌后的蒸馏水，在无菌条件下用接种环轻轻刮下斜面上孢子，将含有孢子的无菌水转入经灭菌后的50ml小三角瓶中，用无菌蒸馏水调整孢子悬液体积至20ml，加入5～10粒直径3～5mm的无菌玻璃珠，在回转式摇床上于250r/min条件下打碎1h；

第五、用5～10ml无菌注射器吸取第四步中经打碎的孢子悬液；

第六、在第五步所述注射器前部加装直径10～25mm无菌过滤头，内装孔径为1.0～5.0μm的醋酸纤维素或尼龙无菌滤膜(滤膜的孔径以孢子直径的1～2倍为宜)，本例中孢子直径约为1.6μm，尼龙无菌滤膜孔径为3.0μm。

第七、手动加压使注射器中的孢子悬液通过滤膜并收集于无菌容器内即得单孢子悬液。

第八、取少量制备好的单孢子悬液于显微镜下观察，单孢子率大于98％。

实施例2、

将链霉菌孢子在无菌条件下，常规培养10天；将0.45μm滤膜过滤的蒸馏水于高压灭菌锅中121℃灭菌25min；试管中加入10ml第三步灭菌后的蒸馏水；回转式摇床上于200r/min条件下打碎2h；醋酸纤维素孔径为5μm，其余条件同实施例1，所制备的单孢子悬液中，单孢子率为99.5％。

实施例3、

将链霉菌孢子在无菌条件下，常规培养6天；将0.45μm滤膜过滤的蒸馏水于高压灭菌锅中121℃灭菌30min；试管中加入10ml第三步灭菌后的蒸馏水；回转式摇床上于150r/min条件下打碎3h；尼龙无菌滤膜孔径为2μm，其余条件同实施例1，所制备的单孢子悬液中，单孢子率为98.6％。