[发明专利]鉴定花椰菜抗黑腐病的特异引物I及鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术中的鉴定花椰菜抗黑腐病的特异引物序列I及其利用该引物序列鉴定花椰菜抗黑腐病的方法。

背景技术

随着人们生活水平的不断提高和对自身健康的高度关注，花椰菜的营养价值和抗病的功效逐渐被人们所认识。已经成为人们喜食的保健蔬菜之一，全世界种植的范围也在逐年增加。花椰菜黑腐病由野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campetris pv.Campetris，Xcc)引起的，该病分布很广，尤其对甘蓝类蔬菜(Brassica oleracea)的生产是破坏性的，导致产量和品质大幅下降，给蔬菜生产造成巨大损失。花椰菜黑腐病主要为害叶片或花球。在高温、高湿的环境条件下，从植物叶缘的排水器中侵入，通过植物的维管束迅速感染，致使植物叶片产生萎蔫、坏死、腐烂，出现典型的“V”字型黑斑，因此称其为“黑腐病”，生产上对该病的控制很困难。因此，植物本身所具有的抗性为控制十字花科的黑腐病提供了有效而廉价的手段。

在常规的抗病育种中需要对分离世代的大量植株进行抗病性鉴定。每一步的抗性检出都要经历接种和选育的过程，这种鉴定不仅费时旷日，且容易受环境影响。分子标记技术的应用，显示出独特的优越性，由于DNA分子标记不存在表达与否的问题，可以直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受取材部位、时间、发育时期和环境的影响，信息量大，准确率高，为分子标记辅助育种和抗病育种在生产上的应用带来前景。根据抗病基因的已知序列设计特异性引物，通过PCR反应对抗病基因的有关区域进行特异性扩增，可以对植株的基因型进行准确的和快速的选择，成倍地提高抗病育种的效率，大大缩短抗性优良育种的选育的周期。

发明内容

本发明的目的是克服常规的抗病育种中需要对分离世代的大量植株进行抗病性鉴定的繁琐过程。提供一对快速早期筛选花椰菜抗黑腐病的特异引物序列，及利用该序列通过分子生物学手段在苗期快速对未知花椰菜品种或植株是否抗黑腐病进行筛查的方法。

本发明的技术方案概述如下：

鉴定花椰菜抗黑腐病的特异引物序列对I，它是由引物序列：

5’CTTTGAATCTTGTGGGCTATGC3’和5’TTTGCCTCCTTTAGGTTAGACT3’组成。

一种使用上述引物序列鉴定花椰菜抗黑腐病的方法，它包括如下步骤：(1)提取花椰菜基因组DNA；(2)基因组DNA的0.8％琼脂糖凝胶电泳检测；(3)特异引物PCR扩增，在PCR扩增专用的离心管中加入：PCR缓冲溶液、dNTP、引物序列对5’CTTTGAATCTTGTGGGCTATGC3’和5’TTTGCCTCCTTTAGGTTAGACT3’、花椰菜基因组DNA、Taq聚合酶、无菌水补至25微升，将装有上述液体的PCR专用薄壁离心管放入PCR扩增仪中，扩增条件为：94℃变性180秒，后进行94℃变性30秒，55—48℃梯度退火40秒(每循环降1℃)，72℃延伸60秒的扩增循环，循环数为7，随后再进入94℃变性30秒，50℃退火40秒，72℃延伸60秒的扩增循环，循环数为28，最后在72℃延伸480秒，扩增完成。(4)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测：配置1.2％的琼脂糖凝胶，在凝胶中加入溴化乙锭(0.5微克/毫升)；在5微升扩增产物及5微升标准阳性Marker中分别加入1微升6×上样缓冲液，混匀，用移液器将上述混合液分别加入浸没0.5×TBE电泳缓冲液液的琼脂糖凝胶的点样孔中，80V恒电压，电泳1800秒后停止电泳。凝胶直接在紫外灯下(紫外波长265nm)或在凝胶成像仪上进行观察。(5)结果判读：依照标准阳性Marker带在凝胶上的迁移位置和PCR产物的迁移位置判断花椰菜抗、感黑腐病情况。上述方法的鉴定结果与田间的吻合率达95％。

附图说明

图1是特异引物序列对I鉴定花椰菜抗、感黑腐病的标准电泳图

图2是利用特异引物序列对I进行田间随机检测的电泳图

具体实施方式

下面结合实施例子和附图对本发明做进一步的说明：

实施例1

利用引物序列：5’CTTTGAATCTTGTGGGCTATGC3’和5’TTTGCCTCCTTTAGGTTAGACT3’对已知抗黑腐病和感黑腐病花椰菜植株进行检测方法，包括以下步骤：

(1)提取抗、感黑腐病花椰菜基因组DNA：采用CTAB方法提取基因组DNA，取幼嫩花椰菜叶片200mg，在液氮里研成粉末，移入10ml离心管中，加入4mlCTAB裂解液，56℃保温30分钟，加入等体积的酚、氯仿，充分混匀后，离心，取上清加入4ml氯仿、异戊醇，混匀后离心，取上清加入等体积的异丙醇，-20℃静置2小时后，10000g离心20分钟，去上清，沉淀用75％的乙醇漂洗后风干后，加入50微升无菌水溶解DNA沉淀，取5微升电泳检测DNA质量；(2)DNA浓度的测定：利用自制的已知标准浓度的凝胶平板测量，一般的浓度要求在200ng以上/μL即可，或者采用紫外分光光度计测量其浓度；(3)进行PCR扩增：在PCR扩增专用的离心管中加入：10×PCR缓冲溶液2.5μL、10mmol/L dNTP0.5μL、10μmol/L引物各1μL、花椰菜基因组DNA 200ng、Taq聚合酶2单位、无菌水补至25μL，将装有上述液体的PCR专用离心管放入PCR扩增仪中，扩增条件为：94℃变性180秒，后进行94℃变性30秒，55—48℃梯度退火40秒(每循环降1℃)，72℃延伸60秒的扩增循环，循环数为7，随后再进入94℃变性30秒，50℃退火40秒，72℃延伸60秒的扩增循环，循环数为28，最后在72℃延伸480秒，扩增完成。(4)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测：配置1.2％的琼脂糖凝胶，在凝胶中加入溴化乙锭(0.5微克/毫升)；在5微升扩增产物及5微升标准阳性Marker中分别加入1微升6×上样缓冲液，混匀，用移液器将上述混合液分别加入浸没0.5×TBE电泳液的琼脂糖凝胶的点样孔中，80V恒电压，电泳1800秒后停止电泳。凝胶直接在紫外灯下(紫外波长265nm)或在凝胶成像仪上进行观察。(5)结果判读：依照标准阳性Marker带在凝胶上的迁移位置和PCR产物的迁移位置判断花椰菜抗、感黑腐病情况。如图1所示：泳道1为DNA标准的分子量箭头示1500bp；2-11为抗黑腐病植株的检测，具有1200bp条带，12-21为不抗黑腐病植株的检测，没有1200bp条带；泳道22为试剂盒提供的标准阳性Marker分子量为1200bp，图2是田间随机取材检测的结果，随机取样的单株随后进行大田抗黑腐病性状观察：大田观察结果证实，凡是具有1200bp条带的表示为抗黑腐病植株，没有1200bp条带的为不抗黑腐病植株。