[发明专利]霍乱毒素B亚单位和蚓激酶融合基因及包括该基因的重组载体及宿主细胞

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域基因重组技术，具体涉及一种融合基因以及基因工程菌的构建方法。

背景技术

蚓激酶(Lumbrokinase，LK)，又称作蚯蚓纤溶酶(Earthworm plasminogen activator，EPA)，是从蚯蚓体内提取的一种具有纤溶活性的蛋白水解酶。它广泛分布于蚯蚓的消化道内腔中，能直接降解血中纤维蛋白原并激活纤溶酶原为纤溶酶。大量研究表明蚓激酶无论静脉或口服给药，均具有溶栓作用。蚓激酶既可直接溶栓，又能激活溶栓；并能降低血小板聚集率(抑制内源凝血功能亢进)，促进血管内皮细胞产生t-PA[Iannucci NB，Camperi SA，Cascone O，Purification oflumbrokinase from Eisenia fetida using aqueous two-phase systems and anion-exchange chromatography，Separation and Purification Technology，2008，64(1)：131-134]，并抑制PAI生成(增强内源纤溶活性)，抑制内皮素(ET)的缩血管作用(舒张平滑肌，缓解血管痉挛)，降低血液粘度(促进微循环)。作为溶栓药物，蚓激酶先后在韩国和中国上市，在脑血管血栓性疾病治疗中显示出明显的疗效。

霍乱毒素(CT)是由霍乱弧菌产生的分子量为84kD的肠毒素，由1个A亚单位(CTA)和5个B亚单位(CTB)形成的五聚体共价连接而成。CTA为毒性亚单位，CTB为无毒的受体结合亚单位，可以和所有有核细胞膜上的神经节苷脂(GM1)受体结合。A亚单位通过B亚单位的作用进入细胞发挥其毒性作用[Sprander BD Structure and function of cholera toxin and relatedEscherichia coil heat lable enterotoxin[J]Microl，Rew.1992，56：622-643]。CTB具有较强的免疫佐剂活性，特别是当其经化学方法或基因融合技术使其与不相关抗原形成偶联蛋白或融合蛋白时，其免疫佐剂活性强于其与不相关抗原混合免疫时的佐剂活性。由于CTB可以和所有有核细胞膜上的神经节苷脂(GM1)受体结合，基于此特性，研究发现CTB不仅可以用于免疫佐剂，还能够作为有效的药物呈递载体。药物在肠道中的通透性成为药物蛋白穿过肠上皮细胞进入血液循环系统的主要障碍。然而受体接导的口服呈递系统为药物蛋白的吸收提供了可行的途径。为了验证CTB是否能够成为有效的蛋白药物呈递载体，Arati等人将CTB与GFP蛋白基因，并在烟草叶绿体中实现了表达。用这种烟草喂食小鼠，并对服用这种烟草的小鼠作了详尽的生理生化分析[Arati Limaye，Vijay Koya，1 Mohtashem Samsam，and HenryDaniell.Receptor-mediated oral delivery of a bioencapsulated green fluorescent protein expressedin transgenic chloroplasts into the mouse circulatory system.The FASEB Journa l2006，20：37-46.]。在这项研究中，他们发现，CTB-GFP融合蛋白能被肠道上皮细胞和肠相关淋巴组织吸收。五聚体融合蛋白能够结合到细胞膜表面的GM1受体上，并通过胞吞作用进入吞噬小体。随后这种融合蛋白进入内质网，在此处，胞内广泛存在的Furin酶将融合蛋白切开，CTB和GFP蛋白分开，CTB被带到细胞的基底一侧，仍然与GM1受体结合着。而GFP分子则通过高尔基体被排除细胞外，从而进入淋巴循环，进一步进入血液循环系统。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种CTB和LK融合基因。

本发明的第二个目的是提供一种构建含CTB与LK融合基因的毕赤酵母表达载体pPIC9k-CTB-Furin-LK。

本发明的第三个目的是提供一种含有CTB和LK融合基因工程菌。

本发明的第四个目的是提供一种CTB和LK融合基因编码的蛋白。

本发明的第五个目的是提供CTB和LK融合基因编码的蛋白在制备口服溶栓药物中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种霍乱毒素B亚单位和蚓激酶融合基因，由序列表中SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列，所述霍乱毒素B亚单位简写为CTB，所述蚓激酶简写为LK。