[发明专利]一种蜘蛛活性多肽及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种从蜘蛛毒液中分离得到的新的活性多肽及其制备方法和应用。

背景技术

蜘蛛又名网虫、盘丝仙，属节肢动物门蛛形纲蜘蛛目，种类很多，全世界有4万余种，我国有4000多种。蜘蛛具有极高的药用价值，性味甘、微苦、微寒、有大毒，具有消炎、消毒、消肿瘤等功能。用蜘蛛入药，具有解毒消炎之功效，主治疔疮、疮疡、毒虫咬伤、口噤、中风口斜、小儿惊风、阳痿早泄等症。用活蜘蛛泡酒，可用来驱湿消炎、解毒、治疗中风、牙痛、风湿骨痛、肾虚等病症。

其中蜘蛛毒素的药用价值尤其受到人们的重视，蜘蛛毒素成分复杂，其中主要成分是多肽和蛋白质，包括多肽神经毒素、细胞毒素、酶、激肽类似物、凝集活性肽和抗菌肽等。此外蜘蛛毒液中还含有多胺类以及A TP、核苷酸、单胺类等低分子质量物质和无机盐等。据报道，蜘蛛毒素对治疗脑溢血等疾病的效果是目前世界上任何一种药物所无法比拟的，可治疗和预防癫痛、老年性痴呆、脑动脉硬化、脑供血不足、中风后遗症等。我国抗衰老研究中心用蜘蛛毒液研制成“脑力再生丸”、“增微一号丸”，用于治疗脑血管和肿瘤等疾病，取得良好效果。蜘蛛毒素在医疗上的其它用途还有：从蜘蛛毒液中可分离出镇痛肽；有些蜘蛛的粗毒中存在对枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌及大肠杆菌有明显抑制作用的抗菌活性肽等。因此，蜘蛛毒素含有大量的活性多肽，这是新药发现的一个重要来源。

发明人将本发明的蜘蛛活性多肽全序列结构经蛋白数据库进行搜索比较，未发现有任何相同的多肽。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从蜘蛛毒液中分离得到的新的活性多肽和其制备方法，以及该活性多肽在治疗抗缺血性脑损伤中的应用。

该蜘蛛活性多肽是一种单链多肽，分子量1862.5，等电点9.82，多肽全序列为：天冬氨酸-亮氨酸-苏氨酸-脯氨酸-苏氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(DLTPTPRGINSRFKPF)。

该蜘蛛活性多肽制备方法为：

a.蜘蛛毒液15000r/min离心8min-12min，取上清液冰冻干燥；

b.DEAE Sephadex A-50离子交换：上述冻干粉溶解于0.05M Tris-HCl，含10mM EDTA，pH 7.3的缓冲液，装于10kDa透析袋，于同样缓冲液透析12小时，DEAE Sephadex A-50(Pharmacia公司产品)阴离子交换柱(500mm长，26mm直径)经于0.05M Tris-HCl，含10mMEDTA，pH 7.3的缓冲液平衡，已透析好的样品上柱，同样缓冲液洗脱，收集活性成分峰。

c.Sephadex G-75凝胶过滤：上述活性峰冻干，溶解于pH 7.8，0.05mol/L Tris-HCl，0.1mol/L NaCl，含10mmol/L的EDTA缓冲液，上样于Sephadex G-75(Pharmacia公司产品)凝胶过滤柱(1000mm长，26mm直径)，用同样缓冲液洗脱，收集活性成分峰。

多肽分子量测定采用快原子轰击质谱法：以甘油∶间硝基苄醇∶二甲亚砜(1∶1∶1，体积比)为底物，Cs+作为轰击粒子，电流1μA，发射电压25Kv。

聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦法测定多肽等电点(韦和平等，生物化学实验与指导，250-253，中国医药科技出版社，2003)。

氨基酸序列测定：将样品置于水解管中，加入6mol/L的盐酸溶液，真空封口。在110℃下水解24h，冷却后过滤和蒸干，再加入0.02mol/L的盐酸溶液在空气中放置30min。采用835-50氨基酸自动分析仪(日本Hitachi公司)测定氨基酸序列。

该多肽用于治疗抗缺血性脑损伤的用途通过减轻PC12细胞缺血缺氧损伤作用和对大鼠局灶性缺血再灌注损伤保护作用的实验例加以说明。

试验例一：蜘蛛活性多肽对PC12细胞损伤的保护作用

1.实验方法

1.1PC细胞培养和传代