[发明专利]一种蜘蛛活性多肽及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种从蜘蛛毒液中分离得到的新的活性多肽及其制备方法和应用。

背景技术

传统医学有“以毒攻毒”的治疗方法，蜘蛛毒素作为一种天然的毒素，对肿瘤细胞可能有杀伤作用。据唐朝陈藏器的《本草拾遗》记载药用蜘蛛“主一切疔肿，附骨疽蚀等疮，宿肉赘瘤”。大多数的文献都报道了蜘蛛毒素有抑制钙通道的成分。当肿瘤侵入组织时，周围的正常细胞变形，并释放能促进或加速肿瘤生长的生长因子，而Ca²⁺通道可能是正常细胞释放生长因子的信号，因此阻断该通道可有助于肿瘤的治疗。在体外研究中，赵维勒报道穴居狼蛛毒某些成分对培养的人肺腺癌细胞的致伤作用。其它学者也陆续报道了蜘蛛毒素在体内和体外均有明显抑制肿瘤细胞的生长，诱导肿瘤细胞凋亡和细胞坏死作用。蜘蛛毒素中含有大量的活性多肽是新药发现的一个重要来源。

发明人将本发明的蜘蛛活性多肽全序列结构经蛋白数据库进行搜索比较，未发现有任何相同的多肽。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从蜘蛛毒液中分离得到的新的活性多肽和其制备方法，以及该活性多肽在肿瘤治疗中的应用。

该蜘蛛活性多肽是一种单链多肽，分子量2188.4，等电点10.49，多肽全序列为：丙氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-苏氨酸-精氨酸-谷胺酰胺-半胱氨酸-丝氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-亮氨酸-亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸(AIGTRQCSSDDALLPFFKRR)。

该蜘蛛活性多肽制备方法为：

a.蜘蛛毒液10000-12000r/min离心15-25min，上清液冷冻干燥；

b.凝胶过滤：上述冻干粉100mg溶解于5mL水，10000-12000r/min离心8-15min除沉淀，SephadexG-50凝胶过滤柱(长1000mm，直径26mm)用0.1mol/LNa₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH6.0缓冲液平衡，充分后上样，用同样洗脱液洗脱，收集活性峰。

c.反相高压液相层析：含1‰三氟乙酸的超纯水充分平衡C18反相柱(长300mm，直径5mm)，用含1‰三氟乙酸的乙晴缓冲液梯度洗脱上述洗脱液，收集活性峰。

多肽分子量测定采用快原子轰击质谱法：以甘油∶间硝基苄醇∶二甲亚砜(1∶1∶1，体积比)为底物，Cs⁺作为轰击粒子，电流1μA，发射电压25Kv。

聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦法测定多肽等电点(韦和平等，生物化学实验与指导，250-253，中国医药科技出版社，2003)

氨基酸序列测定：将样品置于水解管中，加入6mol/L的盐酸溶液，真空封口。在110℃下水解24h，冷却后过滤和蒸干，再加入0.02mol/L的盐酸溶液在空气中放置30min。采用835-50氨基酸自动分析仪(日本Hitachi公司)测定氨基酸序列。

该多肽用于治疗肿瘤的用途通过对体外培养肿瘤细胞及动物性移植肿瘤生长抑制作用的实验例加以说明。

试验例一：对体外培养肿瘤细胞的抑制作用

1、实验材料

96孔板(购自Costar公司)；RMPI1640培养基购自Gibco公司；新生牛血清购自杭州四季青公司；溴化四氮唑蓝(MTT)购自AMRESCO公司；DMSO购自Amresco公司。细胞株：A549人肺癌细胞、SMMC-7721人肝癌细胞、SK-OV-3人卵巢癌细胞。

2实验方案

测定按常规采用溴化四氮唑蓝(MTT)法

(1)取处于指数生长期，状态良好的细胞一瓶，胰蛋白酶消化使贴壁细胞脱落，用含10％小牛血清的RMPI1640培养液配成细胞悬液，计数，接种于96孔板中，细胞密度：0.5-2×10⁴个/mL；

(2)接种入96孔板的细胞在37℃，5％CO₂培养箱培养24小时；

(3)将药物用培养液稀释到10^-4mol/L、5×10^-5mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L、10^-7mol/L五个不同浓度剂量组，100μL/孔，并设立溶媒对照，置37℃，5％CO₂培养箱培养48小时；

(4)孵育48h后加入MTT，20μL/孔，在培养箱继续孵育4小时；

(5)弃净孔内的液体，每孔再加入200μL DMSO，摇床10分钟轻轻混匀；