[发明专利]加强表达N-乙酰谷氨酸激酶的重组钝齿棒杆菌及该菌的应用

说明书

技术领域

加强表达N-乙酰谷氨酸激酶的重组钝齿棒杆菌及该菌的应用，本发明涉及利用L-精氨酸循环合成途径中关键酶基因在钝齿棒杆菌中的加强表达，以提高L-精氨酸产量，属于基因工程技术领域。

背景技术

L-精氨酸(L-arginine)是人体和动物体内的半必需碱性氨基酸，是合成蛋白质肌酸的重要原料，也是生物体尿素循环的一种重要中间代谢产物，具有多种独特的生理和药理作用。L-精氨酸在临床医药、食品、化妆品及有关生物研究领域中用途广泛。发酵法是目前L-精氨酸商业化生产比较有效和经济的方法。

在原核微生物中，L-Arg的合成是从谷氨酸开始，经历了8种酶催化而成。首先，谷氨酸的氨基基团在由argA基因编码的乙酰谷氨酸合成酶的作用下乙酰化，乙酰化作用既阻止了自发环化又阻止了谷氨酸羧基基团被修饰形成脯氨酸。此途径的第5步是乙酰鸟氨酸在酶的作用下脱去乙酰基团形成鸟氨酸，根据脱乙酰基团方式的不同，L-Arg的合成代谢途径分为2种，一种称之为线形途径，即乙酰鸟氨酸在由argE基因编码的乙酰鸟氨酸酶的水解作用下形成L-Arg前体物——鸟氨酸；另一种称之为循环途径，即乙酰鸟氨酸在由argJ基因编码的鸟氨酸乙酰转移酶的作用下形成鸟氨酸的同时，乙酰基团被转移至谷氨酸形成乙酰谷氨酸，在此途径中，鸟氨酸乙酰转移酶表现出二重功能——既具有乙酰鸟氨酸酶的功能又具有乙酰谷氨酸合成酶的功能，故此途径又称为经济循环途径，在肠杆菌(Escherichiacoli)、假单胞铜绿菌(Pseudomonas aeruginosa)及古细菌中的硫化裂片菌(Sulfolobussolf ataricus)以线形途径生产L-Arg，而迄今研究过的所有其他原核微生物，包括嗜温性古细菌、杆状脂肪嗜热菌(Bacillusstearothermophilus)、奈瑟氏淋球菌(Neisseria gonorrboeae)及杆菌属，以及真核微生物都采用循环途径。有报道表明，在肠杆菌中，合成L-Arg的第1个酶——乙酰谷氨酸合成酶是终产物L-Arg反馈抑制的靶目标；而采用循环途径的微生物，被L-Arg抑制的关键酶是合成途径的第2个酶——乙酰谷氨酸激酶或第5个酶——鸟氨酸乙酰转移酶。谷氨酸棒杆菌中被L-Arg抑制的关键酶是乙酰谷氨酸激酶，此酶不仅被L-Arg反馈抑制亦被其反馈阻遏。

随着我国医药营养水平的提高，对精氨酸的需求日益增长，但传统生产L-Arg的高产菌株大多采用诱变筛选的方法获得，但此法有盲目性高、工作量大，且存在突变株生理失调、易退化等局限性；DNA重组技术出现以后，人们开始探索利用DNA重组技术调控合成Arg代谢途径，以达到提高L-Arg产量的目的。

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)是我国研究者分离到的一种钝齿状、无芽孢的革兰氏阳性菌，其突变株在国内氨基酸生产中被广泛应用，但对其遗传背景的研究还处于空白状态。钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA是本实验室筛选得到的高产精氨酸突变菌株。C.crenatum利用循环途径合成精氨酸，乙酰谷氨酸激酶(NAGK)等是合成途径中的关键酶，有些可受到产物精氨酸的反馈抑制和反馈阻遏。利用代谢工程提高L-精氨酸产量最重要的策略之一就是提高关键酶酶量，借助于基因克隆与表达技术，将L-Arg生物合成途径中的关键酶编码基因导入生产菌中，通过增加基因剂量和更换表达调控元件，强化表达，从而达到提高精氨酸产量的目的。导入的关键酶基因既可以是生产菌自身的内源基因，也可是来自非生产菌的外源基因。

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA是革兰氏阳性工业用菌株，尚未见钝齿棒杆菌的遗传表达体系的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株加强表达N-乙酰谷氨酸激酶的重组钝齿棒杆菌及该菌的应用，克隆来自高产精氨酸突变菌株C.crenatum SYPA的精氨酸合成途径中的关键酶基因argB，再通过钝齿棒杆菌表达载体构建重组钝齿棒杆菌来增强其合成途径中酶的表达，从而提高发酵过程中目的产物L-Arg的产量和收率。

本发明的技术方案：一株加强表达N-乙酰谷氨酸激酶的重组钝齿棒杆菌，其分类命名为钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA/pJC1-tac-argB，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M208133。

所述的重组钝齿棒杆菌，其构建所用的表达载体pJC1-tac-argB，采用tac启动子。