[发明专利]利用超低温技术脱除草莓轻型黄边病毒的方法

说明书

(一)技术领域

本发明“利用超低温技术脱除草莓轻型黄边病毒(SMYEV)的方法”属于生物工程领域，利用该方法可以有效的脱除草莓轻型黄边病毒。

(二)背景技术

1超低温脱除病毒的原理

超低温脱除植物病毒法是基于超低温保存结合组织培养和病毒检测技术达到脱毒的目的。超低温保存与茎尖培养相结合是植物脱毒和保存茎尖的一种有效的方法。含有病毒的顶端细胞较大，液泡也较大，液泡中含有的水分也较多，在超低温保存过程中易被形成的冰晶破坏致死，而增殖速度较快的分生组织含的水分少，胞质浓，抗冻性强，不易被冻死。光学显微镜观察显示，液氮中的超低温能杀死含较大液泡的细胞，而保存液泡小的顶端分生组织细胞(Brison M，Boucaud M T，Pierronnet A，Dosba F.Effect ofcryopreservation on the sanitary state of a cv Prunus rootstock exprimentally contaminatedwith plum pox potyvirus[J].Plant Sci，2002，123：189-196.)。这样超低温处理过的植株再生后可能是无病毒的。

2超低温的生物学效用

一般认为超低温的生物学效应主要用于保存种质资源，对象包括植物、动物和微生物等。

超低温保存是指在-80℃以下的环境条件中进行种质资源保存的一套生物学技术。超低温保存常用的冷源有干冰(-79℃)、深冷冰箱、液氮(-196℃)等。在液氮条件下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，生物处于相对稳定的生物学状态。被保存材料可以大大减少甚至终止代谢衰老过程，从而达到长期保存种质的目的。

超低温保存种质资源已经在果树上有了重要的应用，利用超低温保存种质资源的材料可以是传统的种子、花粉、休眠枝条、原生质体、茎尖分生组织和芽等材料，植物茎尖已在超低温保存作为主要的材料。另外，利用超低温保存种质资源的方法也已经较为成熟。

3超低温脱除病毒病在植物中的应用

1997年，Brison M等用超低温结合茎尖离体培养，成功的去除了李属根状茎上的李豆病毒，脱毒率达到50％，比单纯的茎尖培养的脱毒率20％多了近2倍(Brison M，Boucaud M T，Pierronnet A，Dosba F.Effect of cryopreservation on the sanitary state of a cvPrunus rootstock exprimentally contaminated with plum pox potyvirus[J].PlantSci，2002，123：189-196.)。随后，HelliotB等人用超低温成功的去除了黄瓜花叶病毒(CMV)和香蕉条斑病毒(BSV)，脱毒率分别为30％和90％(Helliot B，Panis B，PoumaryY，Swennen R，Lepoivre P，Frison E.Cryopreservation for the elimination of cucumber mosaicand banana streak viruses from banana(Musa spp.)[J].Plant CellRep.2002.20：1117-1122)。Wang等人用包埋玻璃化超低温法成功的去除了葡萄病毒A(GVA)，成功率高达97％，而单独的分生组织培养脱毒率仅为12％(Wang Q，MawassiM，li P，Gafny R，Sela I，Tanne E.Elimination of grapevine virus A(GVA)by cryopreservationofin vitro-grown shoot tips ofvitis viniferaL[J].Plant Sci，2003，165：321-327.)。

4超低温脱除植物病毒法存在的问题和前景展望

超低温脱毒法与茎尖培养脱毒法和热处理脱毒法等传统的脱毒法相比，不仅脱毒率很高，而且简单易行，便于操作，更不需要昂贵的仪器。随着理论和技术的不断发展和完善，低温疗法在植物病毒防治方面将发挥重要作用。但该方法的发展历史还很短，许多问题，如具体材料适用的低温处理方法、低温引起的遗传和表观遗传现象等，尚需进一步研究，尤其是对更多的植物材料的脱毒效果将是今后研究的重点。

(三)发明内容

技术问题