[发明专利]一种杨树利用甘露糖选择标记基因的遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及一种杨树利用具生物安全的甘露糖选择标记基因的遗传转化方法。

背景技术

杨树是世界上重要的造林树种之一，在我国人工林中杨树也有较大比重。在林木植物中杨树是较早开展转基因研究的树种之一，据报道通过基因工程技术已成功转入了抗病虫、耐盐碱、抗大气污染、降低木质素含量、增加生长量等基因，为培育具有优良性状的转基因杨树新品种提供了基础。但由于转基因植物的安全性等问题限制了转基因杨树的环境释放和推广应用。

近年来转基因植物的安全性受到广泛关注，而转基因技术中标记基因的安全性问题已成为当今基因工程研究的热点。目前常用的筛选标记基因主要有两大类，即抗生素抗性酶基因和除草剂抗性酶基因。这些标记基因在完成筛选后并不参与植物的性状改良，且可能对环境或非靶标生物存在潜在风险。糖类分解代谢酶基因作为安全标记基因，近年来在植物遗传转化中显示了巨大的应用潜力。这类标记基因编码产物是筛选剂糖类的分解代谢酶，使转化细胞能利用筛选剂糖类作为主要碳源而获得优势生长，非转化细胞则因饥饿生长而被抑制，故称为正筛选系统。据报道磷酸甘露糖异构酶基因(phosphomannose isomerase，pmi)安全标记基因已成功应用于水稻、棉花、甜橙等转基因研究中。但目前尚未有杨树利用具生物安全的甘露糖选择标记基因的遗传转化系统建立的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种杨树利用甘露糖选择标记基因的遗传转化方法，为培育具生物安全的转基因杨树新品种提供一个新途径。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种杨树利用甘露糖选择标记基因的遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)6-磷酸甘露糖异构酶基因的PCR扩增；

(2)甘露糖选择标记基因表达载体的构建并转入农杆菌；

(3)将杨树试管苗置于基本培养基MS上继代繁殖；

(4)在继代的试管苗上选取幼嫩、平展的叶，剪去叶边缘，剪成预定面积的叶盘为外植体，接种于叶盘分化培养基T上预培养；

(5)挑取步骤(4)得到的农杆菌LBA4404(pMBIA1301-manA)的菌落接种到农杆菌YEB液体培养基中，振荡培养一段时间后，取预定体积转接至YEB液体培养基，待菌体进入指数生长期，通过离心得到菌体，取基本培养基MS液体培养基悬浮菌体，获得侵染菌液；

(6)将步骤(4)的预培养后的叶盘浸入步骤(5)的侵染菌液，振荡，浸泡后，除去多余菌液，放回添加了乙酰丁香酮的叶盘分化培养基T上进行共培养；

(7)对共培养后的叶盘转移到叶盘分化筛选培养基W上培养，直至分化出不定芽；

(8)将不定芽连同外植体一同移入不定芽伸长筛选培养基Y继代培养；

(9)待不定芽伸长至一定长度，将每个不定芽分离独立移入生根筛选培养基G，直至形成完整植体。

步骤(1)中所述6-磷酸甘露糖异构酶基因的PCR扩增方法如下：

上游引物：5′-GGT TAC TTC CCG TAG GAT TC-3′；

下游引物：5′-CGC TAC CAG CGATTTATT C-3′；

扩增模板：大肠杆菌K12菌株DNA；

反应条件：94℃反应5分钟，然后按94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒进行35个循环，72℃延伸10分钟。

步骤(2)中，所述的表达载体为pMBIA1301，其上的抗生素标记基因hyg利用xhol内切酶酶切后由步骤(1)中PCR扩增的manA基因替换。将在-70℃保存的农杆菌(LBA4404)感受态放于冰水中化冻或取新鲜置备的农杆菌感受态1管，加入1μL表达载体质粒(pMBIA1301-manA)，轻轻混匀，冰上30min。液氮速冻1min，37℃温浴3～5min，冰上1～2min，加入800μL YEB液体培养基+Str卡那霉素30mg/L培养基，28℃复苏2～3小时，取200μL菌液均匀涂布于含相应抗生素的YEB固体培养基上，倒置在28℃培养48小时左右。当转化子长出，随机挑选单菌落，液体培养后待用。

步骤(3)中，所述杨树试管苗以根部萌蘖芽方式继代繁殖，试管苗继代时间为约1个月；所述的基本培养基为MS，蔗糖25～30g/L，pH5.6～5.8，琼脂6～7g/L，121±1℃，灭菌16～20分钟。