[发明专利]极耐热葡聚糖酶重组菌固相平板筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物学、基因工程、生物技术等领域，具体涉及极耐热葡聚糖酶重组菌固相平板筛选方法。

背景技术

世界上每年生成1500-2000亿吨植物性有机物，其中约一半为纤维素物质，如何将纤维素物质降解转化为糖、乙醇、甲烷等容易利用的小分子有机物是当前国际上的重大课题之一。目前，对纤维素的降解利用主要采用酸碱化处理等化学手段，以及汽爆及蒸气加热等物理手段。生物法由于对设备要求低，分解后的产物易回收利用，对环境污染较小等特点而备受重视。由于耐热细菌可生长于高温环境，培养过程中不易受常温微生物的污染等优点，分离和筛选多功能的高效纤维素产生菌就显得尤为重要，特别是它产生的纤维素酶具有较好的热稳定性，提高反应温度可加快降解速度，因此耐热纤维素酶在高温领域具有广泛的应用前景。

高温酶的重要研究价值：热稳定性酶在工业上已被广泛应用，它与常温酶类相比有以下优点：1、高温下的热稳定性，大多数酶在70～110℃温度范围内进行，这样可减少污染的危害。2、室温下较长的贮存期，尽可能长的存放期对商品酶制剂尤为重要，尤其是用于诊断试剂中的酶类对贮存期要求更高。3、较高的抗化学变性作用，一般而言，蛋白质的热稳定性越好，其化学变性的可能性就越小。4、高温下的高活性，虽然普通酶类在37℃以下其催化反应速度随着温度上升而加大，但耐热性酶类随温度上升其活性增加的程度比普通酶类更为显著，温度增加使反应体系粘度降低，进一步促进传质效率。有时较高的温度还促使酶催化可逆反应朝着合成目标产物方向进行。5、易于大规模生产及纯化，由于热稳定性的酶大都来到于嗜热和极端嗜热微生物，这些微生物往往难以进行大规模培养，或需要高温发酵设备，因此需要利用基因工程技术构建能高效表达高温酶的常温重组工程菌，后者因在发酵过程中产生的宿主蛋白质绝大多数对热不稳定，因此只要将工程菌的培养液进行一步热处理就可方便地纯化异源高温酶蛋白。

定向进化技术在改造酶的热稳定性方面己表现出一定的优越性，而将这一技术应用在葡聚糖酶热稳定性的改造上在国内外的报道还很少。采用定向进化技术对葡聚糖酶的热稳定性进行改造的过程中，首先需要解决的问题是如何建立高通量的筛选方法，从突变体库快速筛选到热稳定性提高的突变体。

在过去几年，针对不同的实验目的建立了许多有应用价值的的筛选方法，如Joo等(1999)建立的固相平板筛选方法，Mastumura等(1999)建立的滤膜为基础的筛选方法，Nathalie Declerck等(2000)、LoRiGIVER等(1998)和Cherry等(1999)建立的微孔板筛选方法。随着蛋白质定向进化技术的发展，又出现了许多新的高通量筛选技术，如Amstutz等(2001)建立的核糖体展示技术和mRNA展示技术；Kim等(2001)建立的细胞表面展示技术；Forrer等(1999)建立的噬菌体表面展示技术；Firestine等(2001)建立的将靶活力与转录信号相偶联的三杂交体系；Heruberg等(2000)建立的发光信号为指示的反射增进系统；Sounllllion等(2001)建立的荧光共振能量转换仪任(FRET)；Ghadessv等(2001)建立的隔室化自复制技术等^[11]。

对于热稳定性突变体的筛选，目前常用的为96孔板(NathalieDeclerek，2000：LoRiGIVER，1998)，平板筛选方法(Zhao Huimin etal，1999；Toyama et al，1999；Hajime shibuya，2000；肖志壮，2001)和超薄层琼脂板扩散法。但用96孔板筛选耐高温酶时，必须将菌落单个挑入96孔板进行培养，然后对培养液进行热处理和酶活力测定，这样做费时费力，而且由于所用的带色底物很贵，导致检测费用较高。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种极耐热葡聚糖酶重组菌固相平板筛选方法，该筛选方法根据葡聚糖酶在含有适量刚果红的平板上水解固相中的羧甲基纤维素可以产生透明圈的原理设计，筛选方法简单，筛选省时省力。

本发明的技术解决方案是该筛选方法依以下步骤进行：

(1)将直径9cm的尼龙膜夹在两层滤纸中间进行常规121℃灭菌，15min；