[发明专利]一株高产绿原酸水解酶的黑曲霉菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明属工业微生物技术领域，特别涉及一种高产绿原酸水解酶的黑曲霉菌株及其在制备咖啡酸和奎尼酸上的应用。 

背景技术

咖啡酰奎尼酸(Caffeoylquinic acids，CQAs)是植物中主要的生理活性成分，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物，是一个或多个咖啡酸(Caffeic acid，CA)与奎尼酸(Quinic acid，QA)生成的缩酚酸。咖啡酰奎尼酸中最常见的是绿原酸(Chlorogenic acid，5-CQA)，又名咖啡单宁(Coffee Tannins)，其水解产物由等摩尔的咖啡酸和奎尼酸组成。咖啡酸是我国SFDA批准上市的药品，具有升白、抗菌、抗病毒、解蛇毒、中枢兴奋等药理活性。奎尼酸(又名金鸡纳酸，1-羟基六氢没食子酸)是一种极高价值的精细化工产品和医药中间体，除了用于合成神经氨(糖)酸酶抑制剂GS401和GS4104以外，还被广泛用于合成抗肿瘤制剂埃斯波霉素A(Esperamicin-A)、免疫抑制剂FK506和IBE-5抗乙肝病毒药物以及具有抗氧化、抗菌作用的绿原酸(Chlorogenicacid)等。此外，奎尼酸可用作食品添加剂、助溶剂及光学材料等。 

目前，已有的生产咖啡酸方法主要是化学合成和植物提取法，如日本Kokai TokkyoKoho公司的专利JP2002155017公开了由阿魏酸为原料、与BBr₃在二氯甲烷中反应1h，可大规模制备咖啡酸的新方法，但该合成工艺污染环境；该公司的另一专利JP2005348660还公开了采用从甜薯里提取咖啡酸的方法，但是由于植物中咖啡酸衍生物及类似物较多，分离成本较高且难度大；Leonardis A.D.以向日葵种子为原料，采用化学水解法制备了咖啡酸，但需要用高浓度的碱液，对环境不友好(Eur.J.Lipid Sci.Technol.107(2005)220～227)。 

而奎尼酸的现有生产方法则主要是植物提取法和生物合成法，如WO9408015公开了应用转基因大肠杆菌发酵葡萄糖生产奎尼酸的方法，但工程菌构建成本及发酵成本较高，难以实现产业化；日本Kokai Tokkyo Koho公司专利JP2000086575公开了采用溶剂提取法从植物组织水解液中分离奎尼酸的方法，JP11263746公开了采用树脂吸附分离法制备高纯度奎尼酸的方法，JP11140014公开了采用奎尼酸与金属离子成盐形式纯化的方法，但奎尼酸的制备过程都同样涉及到应用大量碱液和有机溶剂，会污染环境。因此，寻找一种能以量大易得的植物，甚至是农林废弃物为原料，通过微生物转化或酶促水解生产咖啡酸和奎尼酸 的高效、环境友好的工艺方法就显得十分迫切和必要。 

绿原酸水解酶EC3.1.1.42(Chlorogenase，Chlorogenate hydrolase，Chlorogenate esterase，Chlorogenic acid splitting enzyme)的现有产生菌有：Parmentier F于1964年首次报道黑曲霉Asperigillus niger产绿原酸水解酶(Arch Int Physiol Biochem72(1964)692～693)；1980年Schoebel，B.首次从黑曲霉Asperigillus niger中分离纯化获得该酶并进行了理化性质研究(Z.Naturforsch.，C：Biosci.，35C(1980)209～212；Z.Naturforsch.，C：Biosci.，35C(1980)699～701)；2003年Smith，Michael A.对绿原酸水解酶的相关功能基因进行了研究(Appl.Environ.Microbiol.，69(2003)524～532)；2005年Nakamori，Kaoru报道了该酶催化转酯化等反应过程(Appl Microbiol Biotechnol，68(2005)198～202；Colloq.Sci.Int.Café，20^th(2005)249～253)；2005年Asther，Michele报道采用该酶水解绿原酸及其酶学性质(J.Biotechnol.，115(2005)47～56)；日本Kokai Tokkyo Koho公司的专利JP2004350619公开采用日本酒曲(koji)水解植物多酚制备咖啡酸的方法、专利JP2006335723公开了采用酶解绿原酸植物提取物获得咖啡酸混合物的方法、国际专利申请WO9533706公开了采用该酶转酯化反应制备咖啡酸的方法。