[发明专利]日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体及其制备方法、应用

说明书

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本发明涉及的是一种日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体及其制备方法、应用，是利用基因工程技术制备日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体，应用overlap PCR法扩增双链抗体基因V_H-linker-V_L(Diabody，简称D)，linker长度选用5个氨基酸残基，序列为GGGGS，强迫两个scFv分子互相形成V_H和V_L配对，以非共价键结合而形成的二聚体，被称为双链抗体。该抗体可以用于急性血吸虫感染的治疗，以及血吸虫病的免疫保护。

背景技术

危害人体的血吸虫主要有日本血吸虫、埃及血吸虫和曼氏血吸虫三种，主要分别分布于亚洲(东部和南部)、非洲和南美洲广大地区，患病人数约2亿左右.在我国流行的是日本血吸虫病，分布在长江流域及其以南的十二个省、市、自治区。解放时全国约有一千余万患者，一亿人口受到本病威胁，有螺面积143亿平方米，是危害农民健康最严重的寄生虫病。我国血吸虫病防治工作取得了很大成绩。但目前长江中下游江湖洲滩地区及大山区的防治任务仍很艰巨，少部分地区血吸虫病疫情有回升、扩展趋势，所以血吸虫病被列为我国“十一五”期间重点防治的重大传染病。目前受血吸虫感染威胁人口约1亿，有现症病人84万，作为重要传染源的牛、羊、猪也有数千万头，所以血吸虫病的防治任务非常艰巨。

目前血吸虫病的治疗以吡喹酮化疗为主，虽然吡喹酮的治疗可取得可靠疗效，但急性血吸虫感染的死亡时有发生，慢性血吸虫病肝脏纤维化尚无有效的治疗方法，可引起显著的门脉高压，由此导致的上消化道出血、脾肿大、腹水，是引起患者死亡、丧失劳动力的主要原因。另外，吡喹酮长期应用还有可能诱发抗药虫株。因此，血吸虫病的治疗仍然存在很多问题，直接影响国家的投资环境，影响和谐社会和小康社会的建设。所以，探索新的高效低毒的血吸虫病治疗药物就显得尤为重要。

Olds根据抗独特型抗体的免疫调节作用，将抗独特型抗体用于曼氏血吸虫急性感染的治疗，研究结果表明抗独特型抗体可降低急性虫卵肉芽肿反应和急性血吸虫感染的死亡率，提示抗独特型抗体有可能用于急性血吸虫感染的治疗。

一株日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30，为肠相关抗原(GAA)的内影像抗独特型抗体，具有模拟抗原的作用，可替代虫源抗原用于血吸虫病免疫诊断和疫苗的研究。研制的血吸虫病NP30抗体检测试剂盒已列入科技部推广计划，现场应用达200万人次。应用NP30主动免疫昆明种、C57BL/6、BALB/c小鼠，对尾蚴攻击感染可分别诱导50.46％、42.05％、39.53％的保护力，主动免疫山羊，也可诱导42.86％的保护力，并对虫卵肉芽肿和肝纤维化具有负调节作用，可明显减轻血吸虫病造成的宿主免疫病理损害，证明NP30具有抗感染免疫和抗病免疫的双重功效。NP30也是我国唯一应用细胞工程技术制备的血吸虫病疫苗候选分子。

ScFv多聚体是通过将单链抗体的连接肽缩短至12个氨基酸以下而构成的一种新型小分子抗体，由单链抗体聚合为二聚体(Diabodies)、三聚体(Tribodies)等形式，使抗原结合价增加、亲和力得到提高、功能多样，具有广阔的应用前景。日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体可以用于急性血吸虫感染的治疗，以及血吸虫病的免疫保护。

发明内容

本发明目的是针对上述不足之处提供一种日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体及其制备方法、应用，是利用基因工程技术制备日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体，应用overlap PCR法扩增双链抗体基因V_H-linker-V_L(Diabody，简称D)，linker长度选用5个氨基酸残基，序列为GGGGS，强迫两个scFv分子互相形成V_H和V_L配对，以非共价键结合而形成的二聚体，被称为双链抗体。该抗体可以用于急性血吸虫感染的治疗，以及血吸虫病的免疫保护。

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体及其制备方法、应用是采取以下方案实现：

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体，即两个scFv分子互相形成V_H和V_L配对，以非共价键结合而形成的二聚体，由228个氨基酸组成，其氨基酸序列为：