[发明专利]一种蝎毒提取物及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种蝎毒提取物及其制备方法，以及在抗血管生成中的应用。

背景技术

世界上对蝎毒提取物的研究很多，也取得了很多成果，目前已证实蝎毒提取物在临床应用和基础研究中对多种肿瘤具有确切的抑制作用，蝎毒提取物可通过下调bcl-2表达等机制促进肿瘤细胞凋亡，及提高机体免疫功能以抗肿瘤。

东亚钳蝎作为一传统中药，在临床常用来治疗心血管疾病和类风湿等免疫性疾病，但目前并不清楚其有效成分，也没有更详细的药理研究，这使其应用与研究受到了很大的限制。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种从东亚钳蝎中提取的蝎毒提取物，并提供了其制备方法与应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种蝎毒提取物的提取方法，包括以下步骤：

(1)用低温电脉冲刺激蝎口尾节得到液态粗毒，与双蒸水混匀，按体积比液态粗毒：双蒸水＝1：1.5～1：2，然后5000～6000转/分离心20～30分钟，低温真空冷冻干燥后得到蝎毒冻干粉。

(2)将上述蝎毒冻干粉用水稀释为浓度1g/40ml、PH7.0～7.6的蝎毒液，然后5000～6000转/分离心20～30分钟，取上清液11000～13000转/分离心20～30分钟，取上清液。

(3)将上述上清液分别用孔径0.45um及0.22um的微孔滤膜过滤一遍，收集滤液，放入冷冻槽冷冻12～36小时，温度—60～—89℃，再将冷冻槽放入冻干机真空干燥48～72h，收取冻干粉。

(4)Sephadex G-50层析：层析柱用葡聚糖凝胶G—50填充，小牛血清50mg/20ml前导吸附；取经微孔滤膜过滤后的冻干粉洗脱，紫外分光光度仪检测，吸收波长280nm，收集蝎毒III—IV蛋白峰，操作温度为5℃。

(5)阳离子交换树脂层析：层析柱用阳离子交换树脂填充，将经G-50收集的蝎毒III—IV上柱，流速0.5ml/分钟，梯度洗脱，紫外分光光度仪检测，吸收波长280nm，收集蛋白峰，操作温度为5℃。

(6)将步骤(5)中得到的含有蝎毒多肽提取物的滤液置入冷冻槽冷冻24小时温度—70℃，再将冷冻槽放入冻干机真空干燥，收集冻干粉。

所述蝎为马氏钳蝎，马氏钳蝎又称为东亚钳蝎，多产于山东。

一种蝎毒提取物，是用上述方法制备的。

所述蝎毒提取物在抗血管生成中的应用。

所述蝎毒提取物在抑制肝癌细胞再增值中的应用。

本发明的蝎毒提取物为从东亚钳蝎中提取的多肽，为含50～60氨基酸的多肽混合物，纯度89.1％，分子量6000～7000道尔顿，耐热，pH稳定，在高效液相色谱显示有4个峰，主峰占总面积的41.4％。

经试验证明，本发明的蝎毒提取物具有确切的抑制新生血管生成作用，包括抑制鸡胚尿囊膜新生血管生成、抑制人脐静脉内皮细胞增殖及抑制肿瘤内新生血管生成。

多种疾病存在异常新生血管生成，如类风湿关节炎患者滑膜中血管生成增加，血管增生是造成滑膜炎，血管翳生长，骨和软骨破坏及骨赘形成的原因。因此抑制新生血管生成，是治疗类风湿关节炎的新方法；使用本发明的蝎毒提取物可有效抑制血管内皮生长因子，从而抑制滑膜内新生血管生成。肿瘤细胞生长依赖血管提供所需的氧气和营养物质，化疗期间肿瘤细胞再增殖过程的加速更需要充足的血供，单独使用或在化疗期间联合应用本发明的蝎毒提取物，可有效抑制肿瘤内新生血管生成，若联合应用化疗药物，如制成含有适量药用辅料的口服剂型或注射剂型，抗肿瘤效果更佳。

本发明的蝎毒提取物还有确切的抑制肝癌细胞再增值的作用。化疗后残存肿瘤细胞再增殖过程加速，是肿瘤细胞产生耐药性的重要原因之一，因此抑制肿瘤细胞在化疗间期再增殖加速对肿瘤治疗有重要意义。实验证实，本发明的蝎毒提取物对多种肿瘤细胞具有杀伤作用。

本发明成功地从东亚钳蝎中提取出了其抑制血管生成和抑制肝癌细胞再增值的有效成分，为以后进一步的研究和应用提供了基础。

附图说明

图1是蝎毒提取物对人脐静脉内皮细胞的作用示意图；

图2是蝎毒提取物对鸡胚尿囊膜新生血管生成抑制示意图；其中，1为对照组鸡胚尿囊膜，2为0.5mg蝎毒提取物干预组，3为0.8mg蝎毒提取物干预组。

图3是单独和联合化疗应用蝎毒提取物对肿瘤内新生血管的抑制作用示意图；其中，1为荷瘤对照组，2为单纯蝎毒提取物干预组，3为蝎毒提取物联合化疗干预组。