[发明专利]利用荧光光素酶和FMN:NADH氧化还原酶进行重金属汞定量检测

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测汞的方法，特别是涉及一种利用海洋发光细菌Photobacterium leiognathi YL胞内荧光光素酶和FMN:NADH氧化还原酶进行重金属汞定量检测的方法。

背景技术

据本发明人通过查阅资料、文献检索所知，目前已知的海洋发光细菌只有三属，分别是弧菌属(Vibrio)，明亮发光菌属(Photobacterium)，及希瓦氏菌属(Shewanella)，陆地上则有异短杆菌属(Xenorhabdus)。在有氧的自然环境下，发光细菌可产生荧光素酶(LE)，催化黄素单核苷酸(FMNH₂)及长链脂肪醛类发生氧化反应，而发出蓝绿色的荧光。

目前在我国应用较广的是明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)，利用明亮发光杆菌进行环境污染物检测的研究有所报道。而除了明亮发光杆菌以外，均没有利用其他种属的发光细菌进行环境污染物检测的报道。本发明中涉及的菌种鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathi)与明亮发光杆菌(Photobacteriumphosphoreum)为同属异种，在菌体形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列上二者均有很大差异。该菌株Photobacterium leiognathi YL表现出稳定的发光性能，对重金属汞敏感，可以定量检测汞。

发光细菌的发光机理的研究表明，不同种类的发光细菌的发光机理是相同的，属酶促氧化反应。是由分子氧作用，胞内荧光酶(LE)催化，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH₂)及八碳以上的长链脂肪醛(RCHO)氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为450～490nm的蓝绿光。

荧光光素酶和FMN-NADH氧化还原酶共同存在下的酶促氧化反应的原理如下：

FMN:NADH氧化还原酶对FMN有特异性，在NADH存在的条件下，将FMN还原为FMNH₂，为发光酶促反应提供底物。荧光光素酶催化FMNH₂和RCHO发生氧化还原反应，同时发出蓝绿色荧光。

目前尚未有利用荧光光素酶和FMN:NADH氧化还原酶进行重金属汞定量检测的报道。

发明内容

本发明的目的是利用一株来源于海洋环境的发光细菌菌株Photobacterium leiognathi YL(鳆发光杆菌YL)胞内荧光光素酶和FMN:NADH氧化还原酶进行汞的定量检测。

本发明分离纯化出一株来源于海洋环境的发光细菌YL为革兰氏阴性杆菌，被鉴定为鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathi)。该菌株于2006年12月27日委托中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏号为M 206139。该菌株的16S rDNA基因序列已经提交GenBank核酸序列数据库，存取号为EF017227。

本发明通过提取发光细菌胞内荧光光素酶和FMN-NADH氧化还原酶粗酶制剂，建立一种荧光光素酶：FMN-NADH氧化还原酶体外发光的体系，实现了荧光光素酶：FMN-NADH氧化还原酶双酶体系在活体细胞外的表达，通过重金属汞对双酶体系发光的抑制来测定汞的浓度。

其双酶体系特征是：

(1)最佳底物配比：十二烷醛100μL(27mM)、FMN-Na53μL(10mM)和NADH 200μL(0.14mM)，体系pH 7.0。

(2)发光检测在微弱发光仪中进行，检测条件是：设置波长474nm，1mL酶液中，快速加入各底物，立刻进行定时跟踪测定，连续测定间隔时间为1s。

其检测体系特征是：

提取发光细菌胞内产物作为荧光光素酶和FMN-NADH氧化还原酶粗酶制剂进行重金属汞的定量测定；

反应温度为4℃，反应时间为15min。

本发明实现了荧光光素酶：FMN-NADH氧化还原酶在活体细胞外的表达，构建了荧光光素酶：FMN-NADH氧化还原酶体外发光体系。该体系发光性能稳定，发光强度高，底物配比简便可行，并可实现汞的定量检测。利用本发明检测汞具有成本低、操作简便、灵敏度高等特点，能够满足汞的快速定量检测的需要。

附图说明

附图1重金属离子对荧光光素酶酶活的影响。

附图2Hg²⁺离子对荧光光素酶酶活的影响。

具体实施方式

实施例1酶液制备