[发明专利]一种EDRF基因片段及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和基因治疗学领域，具体涉及一种治疗β地中海贫血的EDRF基因片段及其相关的表达载体和科研、临床上的应用。 

背景技术

地中海贫血是由于某种或某些蛋白链合成速率降低造成一些肽链缺乏、另一些肽链相对增多，出现肽链数量的不平衡，导致的溶血性贫血。其中β地中海贫血(简称β地贫)，由于β链合成减缺，α链相对过多，多余的α链形成α包涵体。在未分化成熟的红细胞内，α链包涵体可以使细胞膜受到损伤，其中很大一部分在骨髓内被破坏。部分红细胞虽然能成熟并释放至外周血内，但由于α链包涵体附着在红细胞膜上，使红细胞变的僵硬，这种红细胞通过微循环使，易被撕裂，摘除包涵体，形成泪滴状红细胞，且这种红细胞寿命短，易被破坏，产生贫血、铁沉积、脾大等症状，严重危害着患者的身心健康。因此，减少α珠蛋白的沉积造成的危害，对红细胞生理功能的恢复和疾病的治疗具有重要作用。 

红系分化相关因子(EDRF)，又名α血红蛋白稳定蛋白，是一种在红细胞系高表达的蛋白质，与红细胞系的发生密切相关。近年来研究进一步证实，EDRF是α血红蛋白分子伴侣，它能与α血红蛋白结合，但不能与β珠蛋白或血红蛋白四聚体结合。EDRF能维持α血红蛋白的稳定性，保持α血红蛋白可溶性，减弱α珠蛋白沉积对细胞膜的破坏作用。可见EDRF能稳定α血红蛋白，减少过多α血红蛋白造成的危害，当EDRF与α血红蛋白结合后，可使血红素上的铁离子与远端及近端的组氨酸结合，引起α血红蛋白的α螺旋等结构发生一定的改变，这种结构上的改变可有效地抑制活性的氧离子ROS的生成及血红素与α珠蛋白的分离。上述过程是EDRF稳定α血红蛋白、保护细胞损伤作用的机理。 

在本发明之前，β地贫的治疗主要有药物治疗，如羟基脲、丁酸等诱导胎儿型血红蛋白增多以取代β珠蛋白基因合成不足；骨髓移植疗法(但缺乏有效的供体)；转基因治疗(如β-珠蛋白基因)；反义基因治疗异常β链的方法等。但是上述的方法都有缺陷，不能达到满意的治疗效果。而本发明意在创立一种新的治疗方法，应用EDRF稳定过多的α珠蛋白肽链，降低其沉积，目的是减轻多余的α链形成α包涵体的危害，证明EDRF基因表达在红细胞系和疾病治疗中的价值，为地中海贫血的治疗提供新的思路。应用这一新的载体进行β地贫治疗的方法未见报道。 

发明内容

本发明的目的是克服现有治疗方法中的不足，提供一种治疗β地中海贫血的EDRF基因片段及其相关的表达载体。 

本发明的技术方案是： 

(一)有效长度EDRF启动子的筛选： 

1、不同长度EDRF启动子的克隆 

设计不同长度的启动子的序列，用以扩增EDRF启动子。扩增条件如下：变性94℃45s、退火45s、延伸72℃60s，共32个循环。引物序列及退火温度见表1，扩增区域见图1。PCR产物用2％琼脂糖凝胶进行电泳，分析结果。 

2、构建不同的GFP载体分析启动子的作用效果 

用上述不同长度的启动子用于驱动GFP的表达，并构建相应的载体。首先，通过EcoR I和Not I两酶切位点从pGEP-N1载体(Invitrogen)上获得GFP基因，并用同样的酶切位点将GFP连接至pcDNA(3.1+)/ZEO(Invitrogen)载体上，构建pcDNA-GFP载体。然后，将上述启动子经PCR扩增后克隆至pUCm-T载体上(Takara)，构建pUCm-promoter载体。通过EcoRV和HindIII酶切pUCm-T载体获得启动子，并应用Nru I和HindIII酶切位点克隆至pcDNA-GFP载体上，最终获得pcDNA-Pro-GFP载体。 

3、细胞培养和转染 

NIH3T3细胞用含10％胎牛血清的DMEM(GIBICO)培养基培养，小鼠的 MEL细胞用含15％胎牛血清的DMEM培养，并用1.5％的DMSO(Sigma)诱导分化成熟。所有细胞购自上海中科院细胞所，用37℃5％CO2培养。 

4、GFP的检测和分析 

荧光检测：转染后72小时收集细胞，用荧光显微镜(Leica，DMRXA2)观察结果，其中NIH3T3细胞，用0.25％的胰酶消化。 

流式细胞仪分析(FACS)：细胞收集后，用PBS洗2次，然后用流式细胞仪分析结果(Becton Dichinson FACS caliber)，通过GFP的表达反应EDRF启动子的效率。 

(二)pcDNA-EDRF表达载体的构建及其治疗作用 

1、用有效的启动子驱动EDRF表达载体的构建