[发明专利]提取大蒜超氧化物歧化酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物分离工程与技术领域，具体是应用超滤技术从大蒜中分离提取超氧化物歧化酶的方法，单步操作即可获得纯度达95％的超氧化物歧化酶，进一步超滤纯化可获得纯度高达99％且收率达96％的超氧化物歧化酶。

背景技术

超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内一种重要的氧自由基清除剂，能够平衡机体的氧自由基，从而避免当生物体内超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应，在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能，具有广泛的医用价值。

自1938年Mannn和Keilin从牛血红细胞中分离发现该蛋白以来，长期使用有机溶剂沉淀、离子交换、疏水色谱、凝胶过滤和金属螯合亲和层析法等技术从动物血液中提取SOD。这些方法步骤复杂，SOD损失率高，易失活。1997年1月，受疯牛病的影响，欧盟规定不准使用牛血SOD作为食品添加剂。另外，由于动物血液和内脏器官来源有限，且成分复杂，易受污染，在储存运输等方面存在诸多不便。因此人们转而寻求从植物中提取SOD。

大蒜是超氧化物歧化酶(SOD)含量最高的植物之一，其含量可达20,000～30,000U/100g。根据文献报道，目前从大蒜中提取超氧化物歧化酶(SOD)多采用分步盐析法、有机溶剂沉淀法、层析法等传统分离纯化技术。然而这些技术均存在一定的局限性，其中，盐析法和有机溶剂沉淀法容易引起蛋白质的失活和变性；层析法则成本高，处理量小，难于工业放大，目前都仅局限于实验室规模的制备。

膜分离法通常指利用天然或人工合成的薄膜，以外界能量或化学位差为推动力，对双组份或多组分的混合物进行分离、提纯和富集的方法。膜分离技术是20世纪50年代发展起来的一项高效分离技术，与传统的分离技术相比，具有分离效率高、能耗低、可连续操作、易于放大、无污染等优点。

超滤膜是指膜孔径在1～100nm之间，具有不对称结构的复合膜。由于其孔径尺寸与生物大分子的尺寸较为接近，故可用于生物大分子如蛋白质等的分离与纯化。超滤分离是分子级的，即可截留溶液中的大分子溶质，而使小分子溶质透过，有时也可以通过调节溶液中微环境，使预分离的蛋白质分子和膜表面带有不同性质的电荷，再通过蛋白质分子之间、蛋白质与膜表面之间的静电作用，达到分离的目的。目前，在生物加工领域，超滤技术常用于纯化和浓缩蛋白质，在工业上已有较多应用，但由于自然体系中蛋白质种类复杂，且存在较多的同工酶，使用超滤法直接分离得到高纯度的功能蛋白质的实例极少，且这方面的研究仍处于实验室规模。

发明内容

本发明的目的是提供一种环境友好、操作简单、易于工业应用的大蒜超氧化物歧化酶(SOD)超滤提取方法，且所得产品纯度高、收率高。

本发明实现其目的所采取的技术路线是：

1.将去皮大蒜匀浆1～2分钟，向取出的匀浆液中加入3～5倍体积的去离子水或磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液由0～300mM NaCl(最佳为50～200mM)和20～300mM磷酸盐(最佳为50～150mM)组成、pH6.0～8.5，充分搅拌10～30分钟；

2.将上述溶液在30～70℃(最佳为50～65℃)下恒温15～30分钟，使不耐热的蛋白质变性，以沉淀形式析出，滤除沉淀；

3.将上述溶液进行离心操作，条件：室温，转速为5000～8000rpm，弃去沉淀，取上清液；

4.利用截留分子量为10～50kDa的市售超滤膜对步骤3得到的上清液进行超滤分离，条件：室温、pH6.0～8.5，所得截留液为超氧化物歧化酶溶液；

5.再利用截留分子量为70～150kDa的市售超滤膜在室温下对步骤4所得超氧化物歧化酶溶液做进一步纯化，条件：室温、pH6.0～8.5，滤出液即为高纯度超氧化物歧化酶(SOD)溶液；

6.将所得到的超氧化物歧化酶(SOD)溶液在-60℃冷阱中冻干8～10小时，即获超氧化物歧化酶(SOD)干粉。

本发明直接应用超滤分离技术，只用粉碎、热击、离心和超滤四个步骤就可从大蒜溶液中提取获得纯品超氧化物歧化酶(SOD)，与文献报道的盐析法相比，使用相同原料和缓冲溶液条件时，本发明所获得的产品活性约为2500U/mg，高于盐析法(2300U/mg)；收率为6.32mg/100g大蒜鲜重，是盐析法(0.87mg/100g大蒜鲜重)的7倍；且纯度可达99％，较盐析法(83％)高。

具体实施方式

下面结合实施例来进一步描述本发明。