[发明专利]小麦抗白粉病基因Pm23的RAPD标记研究

说明书

技术领域

本发明小麦抗白粉病基因Pm23的RAPD标记研究，利用集群分离分析法(BSA)对抗性基因Pm23进行RAPD分析，以期找到与Pm23紧密连锁的RAPD标记，应用于分子标记辅助选择育种实践中，属于作物遗传育种学领域。

背景技术

小麦抗白粉病基因Pm23是在普通小麦栽培品种中发现的，该基因对当前我国各大麦区流行的小麦白粉菌优势小种表现免疫，并且因其载体品种为普通栽培小麦，没有不良基因的连锁累赘，所以Pm23是小麦抗白粉病育种中不可多得的一个优质抗源。该基因已被定位到5A染色体上，但到目前为止，还没能找到与之连锁的分子标记，这在一定程度上限制了它在抗病育种中的应用。

发明内容

本研究的主要目的是用集群分离分析法(BSA)对抗性基因Pm23进行RAPD和SSR分析，以期找到与Pm23紧密连锁的RAPD标记或SSR标记，应用于分子标记辅助选择育种实践中。

小麦抗白粉病基因Pm23的RAPD标记研究：

1.材料与方法

1.1实验材料

以带有抗病基因Pm23的小麦品系Pm23为抗病亲本，以不具有任何抗病基因的小麦品种Chancellor为感病亲本(同时也兼作感病对照)，配制杂交组合Pm23×Chancellor，F₁代自交，获得101株F₂单株作为分离群体，用于分子标记的筛选和遗传连锁分析。

实验所用材料小麦品系Pm23、Chancellor由中国国家小麦改良中心泰安分中心保存提供。

1.2白粉病抗性接种及鉴定

用当前小麦白粉菌的优势小种NO.15号小种对抗、感亲本、所有的F₂单株进行两次接种，一次在三叶期(盛宝钦等，植物保护，1988，1：49-50)，一次在开花后灌浆期(CIMMTY)，在感病对照充分发病的条件下，调查抗、感分离情况，每隔2-3天重复调查一次，病级鉴定按盛宝钦等(1988)提出的反应型分级标准进行。

1.3基因组DNA的提取

DNA的提取采用Devos(Theor.Appl.Genet，1992，84：567-572)的酚-氯仿提取法，稍有改动，以适于1.5ml离心管提取。

1.4BSA(Bulked Segregate Analysis)分池：

按Michelmore等(1991)提出的分离群体集群分析法(BSA法)，建立抗病基因池和感病基因池，对在双亲间表现多态性的引物进行进一步的筛选。

抗病池和感病池：将F₂群体的单株分别提取总基因组DNA，随机选取10个抗病单株将其DNA等量混合，随机选取10个感病单株将其DNA等量混合，分别建立抗病池和感病池。

1.5SSR分析

1.5.1SSR反应体系扩增程序

小麦SSR引物共97个，其中18个位于5A染色体上，根据Roder等(Mol.Gen.Genet.1998，246：327-333)、Gupta等(TheorAppl.Genet，2002，105：413-422)公布的序列合成。

SSR-PCR反应体系如下：

H₂O                   15.8μl

10×Buffer            2.5μl

Mg²⁺(25mmol/L)        1.5μl

dNTP(2.5mmol/L)       2μl

TaqE(5U/μl)          0.2μl

Primer(2.5μmol/L)    3μl

DNA(30ng/μl)         2μl

                           

总体积(Total)         25μl

1.5.2.SSR扩增程序

扩增反应在Thermal Cycler 9600PCR上进行。先进行一次预扩增：95℃变性5分钟，然后进行30个循环的扩增，每个循环95℃变性1分钟，55℃(复性温度因引物不同而异)复性1分钟，72℃延伸1分钟，最后72℃延伸5分钟。扩增结束后，置于4℃保存待检测。

1.5.3.扩增产物的检测

扩增产物在1.6％聚丙烯酰胺非变性凝胶上稳压110V电泳，印染显色，然后用TanonGis-2010型凝胶成像系统照相观察。