[发明专利]黄尾鰤腹水病毒的实时定量RT-PCR快速检测方法

说明书

技术领域

本发明属于水产动物病原的检测技术，涉及一种采用实时定量逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，简称RT-PCR)技术检测鱼类黄尾鰤腹水病毒的方法——黄尾鰤腹水病毒的实时定量RT-PCR快速检测方法。

背景技术

黄尾鰤腹水病毒隶属于双片段RNA病毒科(Birnaviridae)、水生双片段RNA病毒属(Aquabirnavirus)，于1985年首次从黄尾鰤(Seriola quinqueradiata)分离到。该病毒可以感染鲈鱼、真鲷、日本比目鱼、琥珀鱼、黄尾鰤等鱼类，目前也已经从贝——日本珍珠贝中分离到黄尾鰤腹水病毒。黄尾鰤腹水病毒是严重影响海水养殖鱼类的一种传染性疾病的病原，对亚洲海洋水产养殖业造成了严重的危害。中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局与韩国海洋水产部于2005年发布的《中韩进出口活水生动物检验检疫协议》中规定，中国出口到韩国的鲈鱼、真鲷、大菱鲆、牙鲆等主要海水养殖鱼类必须进行黄尾鰤腹水病毒的检验检疫。在一些海水养殖和海洋鱼类消费的主要国家中，也将该病作为重要的检疫对象。

目前鱼类病毒的检测方法主要包括细胞学诊断技术、免疫学诊断技术、分子生物学诊断技术三大类。细胞学诊断技术主要包括采用细胞培养分离病毒、组织病理切片及电镜观察，其操作繁琐，检测周期长，且灵敏度低；免疫学诊断技术主要包括免疫荧光检测、免疫点杂交，其方法具有特异性强、敏感性高的优点，但方法相当繁琐，不适宜对大量样品进行检测；分子生物学诊断技术主要包括聚合酶链式反应(PCR)，比较快速、灵敏，但是需要琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色观察结果，溴化乙锭是致癌物，对人体和环境有危害，并且交叉污染问题比较严重；另外PCR只能进行定性检测，不能对病毒进行定量检测。

黄尾鰤腹水病毒的检测方法目前主要采用细胞学诊断技术。我国水产养殖业和国际贸易的迅速发展迫切需要建立快速、灵敏、准确的黄尾鰤腹水病毒的检测方法，以尽快检测病原体，打破国外技术壁垒，为国家贸易服务。定量PCR技术目前已被广泛应用于检测水生生物病原体，如对虾白斑综合症病毒、鱼传染性造血器官坏死病毒、副溶血弧菌等，据检索，目前尚未见采用实时定量RT-PCR技术检测黄尾鰤腹水病毒的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄尾鰤腹水病毒的实时定量RT-PCR快速检测方法，以克服现有检测技术的不足，为我国水产养殖业和国际鱼类贸易提供一种快速、简便、高效、实用的检测方法。

为了实现上述目的，本发明的主要原理是采用荧光探针法实时定量PCR技术，反应体系中包括一对PCR引物和一条荧光探针，荧光探针可以与靶序列特异性的结合，荧光探针的5′端标记有荧光报告基团，5′端标记有荧光淬灭基团。当探针完整的时候，报告基团所发射的能量由于荧光共振能量转移而被淬灭基团吸收，因此反应体系中检测不到荧光信号；在PCR反应过程中，引物和探针都与模板结合，Taq酶发挥5′-3′外切核酸酶活性，将荧光探针切断从而使荧光报告基团远离淬灭基团，因此产生可以检测到的荧光信号。随着PCR循环次数的增加，释放出来的荧光信号不断增加，荧光信号强度与扩增产物的数量呈正比关系，仪器记录荧光信号强度，最终计算出循环阈值(Threshold cycle，简称Ct值)。Ct值是指荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，Ct值与模板的初始拷贝数成反比，初始拷贝数越多，Ct值越小；利用已知拷贝数的标准品制备出标准曲线，再根据样品的Ct值，可以对样品中的黄尾鰤腹水病毒进行准确的定量检测。

本发明的技术方案如下：

首先设计特异性引物序列和荧光探针序列，然后提取待测样品的RNA，之后配制实时定量RT-PCR反应体系并按照反应程序进行反应，同时利用体外转录含有目的扩增片段的核糖核酸(Ribonucleic acid，简称RNA)作为标准品进行反应以绘制标准曲线；最后根据定量PCR仪得到的待测样品的Ct值来判定待测样品中是否含有黄尾鰤腹水病毒并进行定量。

本发明所述的设计特异性引物序列和荧光探针序列：选取黄尾鰤腹水病毒的衣壳蛋白基因保守序列，利用已有的Primer Express 2.0软件设计特异性引物序列和荧光探针序列，为：

正向引物：5′-GGCTGATCTCACGGAAATACG-3′；

反向引物：5′-GTCCCATTCAGGGCATACAGA-3′；