[发明专利]检测油菜菌核病菌对多菌灵抗性的引物序列及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种检测油菜菌核病菌对多菌灵抗性的引物序列及其方法。

背景技术

油菜菌核病菌(Sceloritinia sclerotiorum)引起的油菜菌核病是油菜生产上最重要的病害。该病菌在油菜花期开始侵染幼嫩的油菜花，随着带菌花瓣掉落到叶片上，茎杆上，病菌开始蔓延，侵染整株植物。在病害流行的年度，能够引起15％-20％的经济损失。

由于缺乏有效的抗病品种，目前生产上用于防治油菜菌核病的主要方法是化学防治。多菌灵杀菌剂是防治油菜菌核病的主要药剂，但由于该类药剂长期大量使用，在一些地区油菜菌核病菌已对该药剂产生了明显的抗性。油菜菌核病菌中多菌灵抗性菌株的检测对延缓和治理药剂抗性都起着至关重要的作用。

已有研究发现，β-微管蛋白基因编码198或200位氨基酸的密码子发生点突变是导致大多数病原菌产生田间抗药性的主要原因。油菜菌核病菌对多菌灵表现出高水平和中水平两类抗性。在多菌灵高抗的油菜菌核病菌的菌株中，编码β-微管蛋白基因第198位氨基酸的密码子由GAG突变为GCG，从而导致该氨基酸由Glu突变为Ala。该位点的突变，降低了苯丙咪唑类杀菌剂的亲合力，使得菌株表现出高水平抗性。编码β-微管蛋白基因第200位氨基酸的密码子由TTC突变为TAC，氨基酸由Phe突变为Tyr，会导致菌株对多菌灵产生中等水平抗性，同时对乙霉威抗性也增加。

传统的抗药性生物测定方法费时、费力。已报道的ASO-PCR技术仅能检测由198位氨基酸点突变引起的多菌灵抗性，不能检测由200位点突变引起的抗性。因此，需要建立一种新的快速检测技术，准确、全面检测多菌灵抗性的油菜菌核病菌。

发明内容

本发明提供了一种检测油菜菌核病菌对多菌灵抗性的引物序列，该引物特异性高，利用该引物序列能快速、准确、全面检测油菜菌核病菌对多菌灵的抗性。

一种检测油菜菌核病菌对多菌灵抗性的引物序列，包括两组引物，第一组引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO：1所述的碱基序列，第一组引物的反向引物具有序列表中SEQ ID NO：3所述的碱基序列；第二组引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO：2所述的碱基序列，第二组引物的反向引物具有序列表中SEQ ID NO：3所述的碱基序列。

由背景技术可知，油菜菌核病菌对多菌灵的高水平抗性是由于β-微管蛋白基因的第198位密码子GAG突变成GCG所致，第一组引物的正向引物的3’末端碱基为C，使得其与抗性菌株的突变碱基C配对，而不能与敏感菌株碱基A配对，第一组引物的正向引物的3’端倒数第二个碱基为T，使得该正向引物与敏感菌株的DNA的两个碱基产生错位，在相同的PCR反应条件下比只有一个碱基错配的引物特异性更高。

编码β-微管蛋白基因第200位氨基酸的密码子由TTC突变为TAC导致菌株对多菌灵产生中等水平抗性，根据相同的原理，第二组引物的正向引物的3’末端碱基设为A，使得其与抗性菌株的突变碱基A配对，而不能与敏感菌株碱基T配对，为了提高了引物的特异性，第二组引物的正向引物的3’端倒数第二碱基由T变成A。

第一组引物和第二组引物共用一个反相引物，反相引物在β-微管蛋白基因中的第六个内含子内，是对油菜菌核特异的序列。

利用第一组引物对对多菌灵高抗的油菜菌核病菌的DNA进行扩增可以得到403bp的片断，利用第二组引物对对多菌灵中抗的油菜菌核病菌的DNA进行扩增可以得到400bp的片断，利用任何一组引物对对多菌灵敏感的油菜菌核病菌或其它真菌的DNA进行扩增，不能扩增出任何产物。

本发明还提供一种应用上述引物检测油菜菌核病菌对多菌灵抗性的方法，包括以下步骤：

a、提取待检测菌的DNA；

b、以待检测菌的DNA为模板，使用第一组引物和第二组引物进行PCR扩增；

c、PCR产物经凝胶电泳后用EB进行显色，观测凝胶上有无DNA条带，判定待测菌的抗性。

当凝胶上显现DNA条带时，说明待检测菌表现出对多菌灵的抗性，未显现时，则说明待检测菌表现出对多菌灵敏感。当需要确认抗性菌属于高抗还是中抗，应单独使用一组引物对待测菌的DNA进行扩增，扩增产物经凝胶电泳后用EB显色，看凝胶中是否存在DNA条带。

本发明提供的两组引物和方法能同时检测对多菌灵表现高抗和中抗的油菜菌核病菌，检测引物具有很高特异性，且整个PCR和电泳过程仅需2h。因此，本发明的引物和检测方法可用来快速、准确、全面检测油菜菌核病菌对多菌灵的抗性。

附图说明