[发明专利]犬狂犬病病毒NP-ELISA抗体检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种动物病毒抗体的快速诊断方法和器具，具体是一种犬狂犬病病毒NP-ELISA抗体检测试剂盒。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒引起的人兽共患的急性高度致死性传染病，主要侵害中枢神经系统，导致急性、进行性、几乎不可逆性的致死性脑脊髓炎，是当前世界上流行最广、危害最严重的人兽共患传染病。狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病之一，无特效的治疗药物，病死率几乎100％，狂犬病主要分布在亚洲、非洲和拉丁美洲等发展中国家，除英国、新西兰、日本和中国台湾省外，其它国家和地区均有发生。全世界每年约有5.5万人死于狂犬病，其中90％以上存在亚洲和非洲，每年造成的经济损失高达5.83亿美元。我国是世界上受狂犬病危害最为严重的国家之一，每年狂犬病发病和死亡人数位于印度之后，居世界第二位。近几年我国人狂犬病发病数和死亡数呈持续上升趋势，稳居我国法定报告传染病发病总数和死亡总数之第二位，病死率和死亡率则位居各法定报告传染病首位，每年约1000-1200万人接受狂犬病暴露后接种。狂犬病是一种自然疫源性疾病，人和各种温血动物均可感染，感染极为广泛，包括狐、狼、鼠、烷熊、猫、蝙蝠、兔、牛、羊、马、犬等动物，以肉食目的犬科和猫科动物最为易感，人对狂犬病中度敏感。流行病学调查表明，95％以上的人狂犬病病例是与患病或带毒的犬和猫通过直接或间接接触引起的，犬、猫等动物是狂犬病毒的主要储存宿主和传播宿主。因此，加强犬、猫狂犬病的防控对于有效地遏制人狂犬病是十分必要的，其中对狂犬病流行地区的犬、猫等动物施行强制免疫接种与免疫后抗体效价监测相结合，及对疑似带毒动物进行病原检测等则是防控措施的重要环节。

目前，用于狂犬病病毒抗原和血清抗体检测的方法主要有荧光抗体试验(FAT)、小鼠中和试验(MNT)、快速荧光灶抑制试验(RFFIT)、荧光抗体病毒中和试验(FAVNT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等，但这些方法均为全病毒抗原，在样本检测和评价时具有一定的危险性，在一定程度上限制了它们的应用。因此，研制开发适用于犬狂犬病病毒抗体检测的特异的、敏感的、生物安全度高的、适合于基层使用的诊断检测的器具，对犬狂犬病免疫水平进行实时监控和建立科学、灵活的狂犬病的免疫程序，以及对疫病的预防和控制有重要意义

发明内容

本发明的目的是提供一种犬狂犬病病毒NP-ELISA抗体检测试剂盒。

本发明的目的是这样实现的：采用原核表达的狂犬病病毒核蛋白NP作为抗原包被可拆96孔酶标板，以辣根过氧化物酶标记抗犬IgG单克隆抗体制备酶结合物工作液，以间接ELISA法直接检测犬血清中的狂犬病病毒抗体。具体如下：

本发明的犬狂犬病病毒NP-ELISA抗体检测试剂盒内设有NP抗体检测板，酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，10×浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，NP抗体检测板为包被狂犬病病毒核蛋白NP的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记抗犬IgG单克隆抗体，阳性对照为犬狂犬病标准阳性血清，阴性对照为犬标准阴性血清。

狂犬病病毒核蛋白NP为利用原核高效表达系统表达和纯化的基因工程重组蛋白，可与狂犬病病毒核蛋白NP抗体特异结合。它的制备为：利用RT-PCR技术扩增狂犬病病毒ERA活疫苗(国产商品化产品)的1350bp NP基因片段，将其插入到原核表达载体pET-28a(Novagen公司商品化产品)的下游构建pET-NP重组表达质粒，以氯化钙法转化大肠杆菌BL21(DE3)，经0.01mM IPTG诱导表达6h，用超声波裂解表达菌体，NP重组蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化获得，纯化的NP蛋白用于犬狂犬病病毒抗体检测。

抗体检测板的最佳制备条件为：用pH8.5的0.05M Tris-HCl缓冲液作包被液，将狂犬病病毒核蛋白NP稀释为2μg/ml，按100μl/孔加入聚苯乙烯微孔板中，即包被量为200ng/孔，37℃2小时，再4℃包被过夜，甩干，按200μl/孔加入含1％牛血清白蛋白(BSA)，pH7.4的磷酸盐缓冲液37℃封闭2小时，洗涤甩干，再加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时，置干燥室干燥后，装入含干燥剂的包装袋中保存。

酶结合物工作液的制备过程为：

(1)用超纯水配制辣根过氧化物酶(HRP，RZ≥3.0)溶液，加入0.06M过碘酸钠溶液4℃避光1小时，加入160mM乙二醇，室温反应30分钟，加入pH4.4的醋酸缓冲液2-8℃透析过夜，换液两次；