[发明专利]一种埃可病毒30型PCR检测方法

权利要求书

1、一种埃可病毒30型PCR检测方法，其特征在于，按照以下步骤进行埃可病毒30型的PCR检测：

(1)特异性引物的设计：

上游引物：5’>cccaagggttatgaagac<3’

下游引物：5’>cgggcgacactatttact<3’；

(2)总RNA的抽提；

(3)逆转录反应：将步骤(2)抽提得到的总RNA通过逆转录反应得到互补DNA，即cDNA；

(4)聚合酶链式反应，即PCR反应：以步骤(3)逆转录得到的互补DNA作为模板，采用步骤(1)设计的特异性引物对，进行聚合酶链式扩增；

(5)电泳分析：将步骤(4)扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经EB染色后用凝胶成像系统分析。

2、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)RNA的抽提过程：Trizol抽提总RNA。

3、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)逆转录反应步骤：

在冰上操作，依次加入下列试剂

总RNA                          0.5μg

寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸         1μl

混匀，70℃，5min，立刻置于冰上；

5×buffer                     4μl

2.5mM的dNTP mixture           2μl

1.0U/μl的RNA酶抑制剂         1μl

混匀，37℃，5min；

200.0U/μl的逆转录酶          1μl

ddH₂O加到                    20μl

42℃水浴1小时；

70℃水浴10分钟终止反应，得到cDNA。

4、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)聚合酶链反应PCR过程：

ddH₂O                    34.1μL

10×Buffer               5μL

2.5mM的dNTP mixture      4μL

20pmol/μL的上游引物      1μL

20pmol/μL的下游引物      1μL

25mM的MgCl₂              4μL

cDNA                     0.5μL

DNA聚合酶                0.4μL

总体积                   50μL

PCR参数可设置为：95℃变性处理3min后进入循环，94℃ 30S、50℃ 30S、72℃ 1min，30个循环后72℃延伸7min。

5、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(5)反应结束后，PCR产物在1％琼脂糖凝胶0.5×TBE缓冲液中电泳，经EB染色后用凝胶成像系统分析。

6、根据权利要求1或3所述的检测方法，其特征在于，所述cDNA可于-70℃保存，或-20℃保存。

7、如权利要求1所述埃可病毒30型PCR检测方法，用于检测人血清或脑脊液中埃可病毒30型RNA。